病毒诱导的ISG15去共轭作用失调先天免疫和细胞代谢

《Immunity》：Virus-induced deconjugation of ISG15 dysregulates innate immunity and cellular metabolism

　　

干扰素刺激基因15（ISG15）编码一种泛素样蛋白，通过其与蛋白质的共轭作用（即ISGylation过程）调控多种细胞反应，包括抗病毒免疫。包括SARS-CoV-2在内的多种病原体通过编码去ISG化酶来破坏ISGylation。然而，冠状病毒去ISG化的直接靶标和生理后果仍不明确。在此，研究人员通过遗传手段消融了SARS-CoV-2编码的类木瓜蛋白酶（PLpro）的去ISG化活性，发现去ISG化丧失增强了先天免疫激活，减弱了病毒复制，并促进了人细胞和小鼠中的病毒清除。代谢组学、ISGylome蛋白质组学和功能分析揭示，PLpro去ISG化通过直接调控控制糖酵解、磷酸戊糖途径和氧化还原稳态的关键酶活性，解除病毒感染的新陈代谢限制。这些发现为可逆ISGylation如何在分子水平调控免疫和代谢过程提供了基础性见解，并强调病毒去ISG化是克服宿主免疫代谢防御的主要策略。

**研究背景、问题与研究目的**
ISGylation是一种由干扰素诱导的可逆翻译后修饰，其中ISG15（干扰素刺激基因15）通过共轭作用修饰靶蛋白，调控其相互作用、稳定性、亚细胞定位及信号能力，从而在抗病毒免疫中发挥关键作用。宿主通过HERC5等E3连接酶介导ISGylation，激活免疫传感器如MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）、cGAS（环状GMP-AMP合酶）和STING（干扰素基因刺激物），以抑制病毒复制。然而，多种病毒编码去ISG化酶来逆转这一过程，恢复病毒蛋白功能并抑制先天免疫。SARS-CoV-2编码的类木瓜蛋白酶（PLpro）是Nsp3蛋白的一部分，兼具去泛素化（DUB）和去ISG化活性，但此前难以在重组病毒中特异性消融去ISG化活性，其生理功能以及是否通过去ISG化重编程宿主代谢尚不清楚。为阐明这些机制，研究人员通过结构引导设计分离功能突变，成功拯救出PLpro去ISG化活性消融的重组SARS-CoV-2（SARS2mut），并系统研究了其在免疫逃逸和代谢重编程中的作用。

**研究人员开展的研究、结论及意义**
研究人员在VeroE6-TMPRSS2细胞中拯救出携带N156E/Y171R突变的SARS2mut，该突变选择性破坏PLpro结合ISG15的能力而不影响其蛋白酶或DUB活性。在人细胞（Caco-2、A549^ACE2、SVGA^ACE2、HBEpC、HNEpC）和K18-hACE2小鼠中，SARS2mut表现出复制减弱、先天免疫激活增强及病毒清除加速。代谢组学、U-¹³C-葡萄糖示踪、全ISGylome蛋白质组学及Nsp3相互作用组分析揭示，PLpro去ISG化直接靶向并调控糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和氧化还原稳态的关键酶，包括ALDOA（醛缩酶A）、G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）和PRDX1（过氧化物还原酶1）。ISGylation抑制这些酶活性，而PLpro去ISG化恢复其功能，从而维持病毒复制所需的代谢环境并保护病毒RNA免受氧化损伤。该研究发表于《Immunity》，揭示了可逆ISGylation在分子水平调控免疫和代谢的机制，并提出病毒去ISG化是克服宿主免疫代谢防御的核心策略，为开发靶向PLpro去ISG化活性的减毒疫苗或治疗药物提供了依据。

**主要关键技术方法**
1. 反向遗传学：利用优化环状聚合酶延伸反应（CPER）方法构建重组SARS-CoV-2突变体（SARS2mut），在VeroE6-TMPRSS2细胞中拯救。
2. 代谢组学分析：对原代人支气管上皮细胞（HBEpC）进行非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和U-¹³C-葡萄糖示踪，结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。
3. 全ISGylome蛋白质组学：在A549细胞中表达Nsp3-4融合蛋白，经IFN-α处理，用USP2cc去除泛素化后，以抗K-ε-GG抗体富集ISG化肽段，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。
4. Nsp3相互作用组蛋白质组学：在SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中，以抗Nsp3抗体进行免疫共沉淀，结合质谱鉴定宿主互作蛋白。
5. 功能验证：通过siRNA沉默、CRISPR-Cas9敲除、酶活测定、半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）、非还原SDS-PAGE以及免疫荧光共定位分析。
6. 样本队列来源：人扁桃体组织来自扁桃体切除术患者（去标识），用于生成人扁桃体类器官。

**研究结果**
**A PLpro deISGylation-ablated rSARS-CoV-2 is attenuated and elicits heightened innate immunity**
通过结构叠加分析，研究人员在PLpro的α-螺旋7远端和α-螺旋6尖端设计N156E/Y171R双突变，该突变几乎完全消除PLpro的去ISG化活性，但保留蛋白酶和DUB功能。成功拯救出重组病毒SARS2mut，其基因组稳定。在干扰素缺陷的VeroE6-TMPRSS2细胞中，SARS2mut复制与野生型（SARS2WT）相当；但在干扰素感受态细胞（Caco-2、A549^ACE2、HBEpC）和K18-hACE2小鼠中，SARS2mut病毒滴度降低约1-log，并诱导更强的MX1蛋白表达及I型干扰素、促炎细胞因子和ISG转录本，同时伴随免疫细胞浸润减少和病毒抗原降低。JAK抑制剂鲁索替尼几乎完全恢复SARS2mut复制，表明增强的干扰素反应是其衰减的主要原因。

**Viral deISGylation suppresses signaling mediated by MDA5 or the immune adaptor TRIF**
RNA-seq分析显示，SARS2mut感染Caco-2和HBEpC细胞后，ISG相关基因上调更显著。siRNA沉默实验表明，在Caco-2、SVGA^ACE2和HMC3^ACE2细胞中，SARS2mut诱导的ISG表达依赖于MDA5-MAVS通路；而在HBEpC中，则依赖于TRIF（TIR结构域含接头蛋白诱导干扰素-β），而非MDA5、RIG-I、MAVS、MyD88或STING。TRIF特异性阻断肽Pepinh-TRIF可消除SARS2mut诱导的免疫信号。值得注意的是，TRIF本身未检测到ISG化，且不与Nsp3相互作用，提示PLpro去ISG化通过其他分子调节该通路。

**Nsp3-PLpro-mediated deISGylation rewires cellular metabolism**
非靶向代谢组学分析显示，与SARS2WT相比，SARS2mut感染HBEpC细胞导致葡萄糖-6-磷酸（G6P）积累，同时核糖-5-磷酸（R5P）、核酮糖-5-磷酸（Ru5P）和还原型谷胱甘肽（GSH）减少。U-¹³C-葡萄糖示踪实验在非感染条件下表达Nsp3-4 WT或突变体，证实PLpro去ISG化活性能够逆转IFN-α诱导的糖酵解和PPP通量抑制，表明PLpro维持了高效的葡萄糖利用。

**Integrated proteomics analysis identifies PLpro deISGylation substrates**
全球ISGylome蛋白质组学鉴定出2,735个K-ε-GG肽段，其中1,015个（对应578个蛋白）在IFN-α刺激后显著增加，并在Nsp3-4表达后显著减少，定义为PLpro去ISG化底物。Nsp3相互作用组分析在SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中鉴定出292个宿主互作蛋白，其中61个与ISGylome数据集重叠，代表高置信度PLpro底物。基因本体分析显示这些底物富集于翻译调控、代谢过程、RNA稳定性、先天免疫应答和氧化应激应答等通路。

**Nsp3-PLpro deISGylates ALDOA and G6PD for efficient viral replication**
ALDOA是糖酵解和PPP的关键调节酶。实验证实内源性ALDOA在IFN刺激下发生ISG化，且ISG化抑制其酶活。PLpro去ISG化恢复ALDOA活性，而Nsp3突变体无此效果。在感染中，SARS2WT感染未检测到ALDOA ISG化，但PLpro抑制剂GRL0617处理或SARS2mut感染均可诱导ALDOA ISG化。ISG化位点K13、K42和K101的联合突变（3KR）几乎消除ALDOA ISG化，且该突变体不受ISG化抑制。结构分析显示K13位于二聚体界面，K42靠近活性中心，K101邻近催化调节残基I98。SDD-AGE实验表明ISG化抑制ALDOA寡聚化，而PLpro去ISG化逆转此效应。在ALDOA敲除后回补WT或3KR的A549^ACE2细胞中，SARS2mut复制在3KR回补细胞中部分恢复。
G6PD是PPP的限速酶，其ISG化位点K403位于二聚化结构域，与结构NADP⁺结合有关。ISG化抑制G6PD酶活，PLpro去ISG化恢复活性。G6PD K403R突变体部分恢复SARS2mut复制。这些结果说明PLpro通过去ISG化维持ALDOA和G6PD活性，促进核苷酸合成和抗氧化能力。

**PRDX1 deISGylation promotes antioxidant responses to prevent viral RNA oxidation**
SARS2mut感染导致GSH减少和氧化应激升高，病毒RNA氧化（8-OHG）和蛋白羰基化增加。PRDX1作为关键过氧化物酶，在IFN刺激下发生ISG化，且ISG化抑制其过氧化物酶活性。PLpro去ISG化恢复PRDX1活性。ISG化位点K7和K93的联合突变（2KR）几乎消除ISG化并维持酶活。非还原SDS-PAGE表明ISG化抑制PRDX1二聚化，而K7R突变可逆转此效应。在PRDX1敲除后回补WT或2KR的A549^ACE2细胞中，SARS2mut诱导的病毒RNA氧化在2KR回补细胞中减弱，病毒复制部分恢复。用小分子N-乙酰半胱氨酸（NAC，GSH前体）和D-核糖（R5P前体）联合处理HBEpC和人扁桃体类器官，几乎完全恢复SARS2mut复制，证实氧化应激和PPP输出不足是SARS2mut衰减的关键因素。此外，携带β冠状病毒的蝙蝠（Pteronotus mesoamericanus）PRDX1天然存在K7R突变，其ISG化水平显著降低，提示进化适应。

**总结讨论与结论翻译**
讨论部分指出，PLpro去ISG化通过多层级机制协调抗病毒信号和代谢适应：主要抑制MDA5-MAVS和TRIF介导的先天免疫，同时解除ALDOA、G6PD和PRDX1等代谢酶的ISG化抑制，维持糖酵解、PPP通量和氧化还原稳态。此外，PLpro去ISG化还保护病毒RNA免受氧化损伤，而蝙蝠PRDX1的天然突变可能帮助维持高代谢活性下的氧化还原平衡。研究还鉴定出其他候选底物（如ACLY、DDX1、G3BP1），其功能有待进一步阐明。
研究结论翻译：“我们的研究定义了SARS-CoV-2通过PLpro介导的去ISG化失调宿主细胞免疫并劫持代谢的全局图景。去ISG化活性的消融导致SARS-CoV-2衰减并增强先天免疫。SARS-CoV-2 PLpro诱导的去ISG化阻碍MDA5或TRIF介导的信号传导。病毒去ISG化重塑特定细胞内代谢途径。ALDOA、G6PD和PRDX1的去ISG化促进病毒复制。”