CCR7+活化树突状细胞对自发及免疫治疗驱动的抗肿瘤免疫至关重要

《Immunity》：CCR7+ activated dendritic cells are essential for spontaneous and immunotherapy-driven anti-tumor immunity

　　

单细胞转录组学鉴定出1型和2型常规树突状细胞（cDC1和cDC2）共享的一种汇合活化状态。这些活化树突状细胞（actDCs）的特征是共表达T细胞刺激分子和抑制分子。在此，研究人员通过开发利用CCR7表达条件性标记或消融actDCs的小鼠模型，研究了actDCs对抗肿瘤免疫的功能贡献。cDCs刺激肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的能力仅限于actDC状态。源自cDC1和cDC2的actDCs分别通过交叉呈递和交叉着装支持CTL启动，后者以癌症类型依赖的方式发生。actDCs对于肿瘤引流淋巴结中初始CTLs的激活以及维持肿瘤内效应CTL功能是必需的。因此，actDCs的消融损害了自发肿瘤控制以及对免疫检查点阻断或过继T细胞治疗的反应。从而，actDC状态成为cDC介导的抗肿瘤免疫的关键决定因素。

**论文解读：CCR7⁺活化树突状细胞在抗肿瘤免疫中的核心作用**

**研究背景与问题**

常规树突状细胞（conventional dendritic cells, cDCs）是连接天然免疫与适应性免疫的关键抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APCs），在肿瘤免疫中发挥核心作用。cDC1亚群通过交叉呈递（cross-presentation）肿瘤抗原激活CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），而cDC2亚群的功能相对模糊。近年来，单细胞转录组学揭示了一类源自cDC1和cDC2的趋同活化状态，即活化树突状细胞（activated DCs, actDCs），其特征为高表达CCR7、共刺激分子（CD80、CD86、CD40）以及免疫抑制分子（PD-L1、PD-L2）。然而，由于actDCs在肿瘤组织中数量稀少，且缺乏特异性标记工具，其整体功能贡献——尤其是对自发肿瘤控制和免疫治疗应答的作用——一直存在争议，甚至被部分研究认为具有免疫抑制功能。因此，亟需开发遗传学工具以精确标记、追踪或消融actDCs，从而明确其在抗肿瘤免疫中的净效应。

**研究概述与结论**

研究人员通过构建两种新型基因工程小鼠模型（Ccr7^{LSL-mScarlet-I}和Ccr7^LSL-DTR），结合不同的Cre驱动子，实现了对全部actDCs或仅cDC1来源actDC1s的条件性标记或急性消融。利用这些模型，研究人员发现：actDC状态是cDCs刺激肿瘤特异性CTLs的唯一功能状态；actDC1s通过经典交叉呈递启动CTLs，而actDC2s则依赖交叉着装（cross-dressing）机制获取肿瘤细胞表面的肽-MHC-I复合物，且该作用具有癌症类型依赖性；actDCs在肿瘤引流淋巴结（tdLNs）中初始CTL的激活及肿瘤内效应CTL功能的维持中均不可或缺。消融actDCs会严重损害自发肿瘤排斥、免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）及过继T细胞治疗（adoptive T cell therapy, ACT）的疗效。该研究发表于《Immunity》，确立了actDC状态作为cDC介导抗肿瘤免疫的关键决定因素的地位。

**主要技术方法**

1. **遗传学小鼠模型构建**：采用CRISPR-Cas9技术，分别在Ccr7基因3'端插入loxP-STOP-loxP（LSL）盒控制的mScarlet-I荧光蛋白或人白喉毒素受体（DTR）cDNA，生成Ccr7^{LSL-mScarlet-I}（报告小鼠）和Ccr7^LSL-DTR（消融小鼠）品系。通过与CD11c-Cre或Xcr1-Cre驱动子交配，实现条件性标记或消融。
2. **单细胞转录组学**：对5555黑色素瘤和CT26结直肠癌模型的肿瘤浸润CD45⁺细胞进行scRNA-seq，鉴定actDC簇及其特征基因。
3. **体外actDC诱导体系**：将FLT3L诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）与活癌细胞共培养，模拟肿瘤浸润actDC状态。
4. **体内功能分析**：通过DT注射急性消融actDCs，结合OT-I细胞转移、ICB（抗CTLA-4+抗PD-1）和ACT治疗，评估actDCs在CTL启动、肿瘤控制及免疫治疗响应中的作用。
5. **成像流式与显微镜**：利用actDC1-Sca报告小鼠进行组织切片荧光成像，分析actDC1s的微解剖分布。

**研究结果**

**1. 小鼠品系实现CCR7⁺ actDCs的条件性标记**
通过对5555和CT26肿瘤的scRNA-seq分析，研究人员鉴定出一个转录上独立的cDC簇，高表达Ccr7、Fscn1、Cd80、Cd40、Il12b、Cd274等基因，符合mregDC/migDC特征。轨迹推断和RNA速率分析表明该簇是cDC1和cDC2的趋同活化状态，称为actDC。利用Ccr7^{LSL-mScarlet-I}与CD11c-Cre杂交（actDC-Sca），可标记所有CCR7⁺ CD11c⁺细胞；与Xcr1-Cre杂交（actDC1-Sca）则仅标记actDC1s。在多种肿瘤模型中，Scarlet⁺ cDCs约占cDC1和cDC2的20%–40%，且表型上上调MHC-II、PD-L1、PD-L2，其中actDC1s特异性表达IL-12。组织成像显示actDC1s富集于淋巴结T细胞区、脾脏T细胞区、胸腺髓质，并在肿瘤内主要位于CD31⁺血管周围30 μm范围内。

**2. 体外共培养重现肿瘤浸润actDC状态**
研究人员将BMDCs与活癌细胞共培养，发现Scarlet⁺ actDCs比例随时间增加，且表型与肿瘤浸润actDCs一致：上调MHC-I/II、共刺激分子和抑制分子，IL-12仅见于actDC1s。scRNA-seq证实体外actDCs与体内actDCs转录高度相似，并可进一步分为actDC1和actDC2亚群。肿瘤细胞来源的PGE2被鉴定为促进actDC分化的可溶性因子之一，但微生物刺激（如poly I:C、LPS）可进一步增强活化标志物表达。

**3. CD8⁺ T细胞启动局限于actDC状态**
从BMDC-癌细胞共培养物或tdLNs中分选四种cDC亚群（restDC1、actDC1、restDC2、actDC2），与OT-I细胞共培养。结果显示，只有actDC1和actDC2能诱导OT-I增殖，restDC无此能力。加入TLR9激动剂CpG后，所有亚群均能启动OT-I，表明restDC缺乏的并非抗原摄取能力，而是活化状态。成像流式证实actDC1s摄取肿瘤材料最多，但摄取本身并非actDC分化的前提。

**4. actDC2s通过交叉着装启动CD8⁺ T细胞**
利用β2-微球蛋白（β2m）敲除的5555OVA细胞（MHC-I缺陷），发现actDC2s在tdLNs中完全丧失启动OT-I的能力，而actDC1s仍保留活性。在cDC1缺陷（Irf8^Δ32）或交叉呈递缺陷（Wdfy4^-/-）小鼠中，MHC-I缺陷肿瘤导致CTL启动进一步下降，证实交叉着装在cDC1功能受限时发挥补充作用。使用B16OVA细胞时，仅actDC1s可启动OT-I；但IFNγ预处理B16OVA细胞上调MHC-I后，actDC2s恢复启动能力，且该作用依赖于MHC-I表达。

**5. actDC-DTR模型实现急性actDC消融**
Ccr7^LSL-DTR与CD11c-Cre杂交生成actDC-DTR小鼠。一次DT注射即可在16–24小时内选择性消融肺部actDC1和actDC2，而不影响restDC。该模型为后续体内功能实验提供了可靠工具。

**6. actDCs是自发CTL介导肿瘤排斥所必需**
在免疫原性5555OVA肿瘤模型中，actDC-DTR小鼠经DT处理后，肿瘤自发消退被阻断，伴随循环中H-2K^b-SIINFEKL特异性CD8⁺ T细胞减少，瘤内CD8⁺和CD4⁺ T细胞数量显著下降。急性消融actDCs后，转移的OT-I细胞在tdLNs中几乎无法激活，直接证明actDCs是初始CTL启动的必需条件。FTY720阻断淋巴细胞迁出实验表明，持久的抗肿瘤免疫需要持续的CTL启动和从淋巴结到肿瘤的运输。

**7. ICB和ACT的疗效依赖actDCs**
在5555肿瘤模型中，actDC消融显著降低抗CTLA-4/抗PD-1联合治疗的疗效，约40%小鼠出现肿瘤进展，瘤内CD8⁺ T细胞数量和IFNγ产生减少。在Rag1^-/-（缺乏内源T/B细胞）背景的actDC-DTR小鼠中，过继转移预活化的OT-I细胞后，actDC消融严重损害ACT疗效，约三分之二小鼠几乎无治疗获益。分析瘤内OT-I细胞发现，actDC缺失导致OT-I细胞高表达PD-1、CD39、LAG3、2B4、TIGIT和TOX，提示加速了T细胞功能障碍。

**总结与讨论**
本研究通过新型遗传工具首次正式证明，actDC状态是cDCs发挥抗肿瘤功能的核心，并阐明了actDC1和actDC2在抗原呈递机制上的差异：actDC1依赖交叉呈递，actDC2依赖交叉着装，后者受癌细胞表面MHC-I丰度调节。actDC的消融不仅破坏自发肿瘤控制，还严重削弱ICB和ACT的疗效，表明actDC在维持肿瘤内效应T细胞功能中起关键作用。研究结论部分指出：“总之，我们描述了能够识别和条件性操纵actDCs的新小鼠模型，为探索其在多种疾病中的生物学提供了多功能平台。利用这些工具，我们证明了actDC状态对于天然CTL介导的抗肿瘤免疫以及ICB和ACT的疗效至关重要，将actDC定位为有希望的治疗靶点，以改善依赖免疫系统抗癌功能的免疫疗法和其他癌症治疗的效果。” 该研究为未来基于actDC的免疫干预策略（如增强actDC分化或逆转其抑制功能）奠定了坚实的基础。