溶酶体功能障碍驱动神经退行性疾病中疾病相关小胶质细胞的转录和表观遗传特征

《Immunity》：Lysosomal dysfunction drives a transcriptional and epigenetic signature found in disease-associated microglia in neurodegenerative diseases

　　

溶酶体功能障碍与多种溶酶体贮积症中的神经退行性变存在因果关联，并与多种年龄相关性神经退行性疾病相关。在此，研究人员利用由溶酶体水解酶SGSH缺陷导致的小鼠黏多糖贮积症ⅢA型（MPS-IIIA）模型，探讨了其潜在机制。系统的影像学、转录组学和表观遗传学研究揭示，在Sgsh缺陷小鼠脑内，小胶质细胞是受影响最深刻的细胞类型。进一步研究确定了MITF/TFE家族成员在溶酶体应激所导致的小胶质细胞特异性表观遗传和转录改变中发挥主导性且具有背景依赖性的作用，该作用依赖于与AP-1/ATF、C/EBP及PU.1/ETS转录因子（TFs）的协同互作。在鼠源Sgsh缺陷中观察到的转录组和表观遗传改变特征，同样在年龄相关性神经退行性变小鼠模型来源的小胶质细胞以及人类阿尔茨海默病（AD）患者中观察到。这些发现揭示了与疾病相关小胶质细胞（DAM）表型相关的共同及疾病特异性的转录机制。

**论文解读：溶酶体功能障碍驱动疾病相关小胶质细胞转录与表观遗传特征的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

溶酶体贮积症（lysosomal storage diseases，LSDs）是由溶酶体相关基因致病性变异引起的一类疾病，是儿童期神经退行性变和痴呆的主要原因，表明单纯的溶酶体缺陷足以驱动导致神经元功能障碍和死亡的病理过程。溶酶体不仅负责大分子降解，还作为代谢和炎症信号枢纽，以细胞类型特异性方式调控自噬、能量稳态、炎症和吞噬作用。自噬体和内溶酶体功能障碍与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、帕金森病（Parkinson's disease，PD）、额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等年龄相关性神经退行性疾病密切相关，这些疾病的风险变异常影响内溶酶体生物学相关基因。此外，局部环境扰动（如摄取抗降解蛋白聚集体或毒性颗粒）也可导致溶酶体功能障碍。

在LSDs中，所有细胞均携带致病性变异，但失去必需溶酶体功能的细胞类型特异性后果仍知之甚少。虽然部分效应预期是神经元细胞自主性的，但神经元功能障碍/死亡也可能源于其他细胞类型（如小胶质细胞）的影响。小胶质细胞需要强大的溶酶体能力来处理自噬和吞噬货物并维持神经稳态，而疾病相关的溶酶体功能障碍可使这些细胞转向适应不良的炎症/神经毒性程序。然而，对于任何LSD，失去必需溶酶体酶如何重塑跨脑细胞类型的基因表达程序的转录机制尚未明确。

黏多糖贮积症ⅢA型（mucopolysaccharidosis type IIIA，MPS-IIIA；Sanfilippo综合征A型）是一种严重的神经退行性LSD，由溶酶体硫酸酰胺酶SGSH的双等位基因功能缺失突变引起，该酶为硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）降解所必需。受影响的儿童出现进行性行为、运动和认知障碍/痴呆，通常在青春期晚期死亡。Sgsh^-/-小鼠重现了关键疾病特征。在人类和小鼠中，SGSH缺乏导致HS（脑细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要成分，小胶质细胞主动重塑该成分）的溶酶体积累。共同神经病理学包括小胶质细胞增生、星形胶质细胞增生和继发性大分子/脂质积累。疾病修饰疗法仍未实现，凸显了理解SGSH缺乏如何影响不同脑细胞的必要性。

**二、研究主要技术方法**

研究人员利用Sgsh^-/-（MPS-IIIA）小鼠模型，综合运用多种前沿技术开展研究。主要技术包括：透射电子显微镜（transmission electron microscopy，EM）分析脑超微结构；单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）解析转录组变化；批量RNA测序（bulk RNA-seq）追踪时间依赖的基因表达变化；转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin with sequencing，ATAC-seq）和组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）分析表观遗传景观；对MITF、TFEB和TFE3进行ChIP-seq以解析转录因子（transcription factors，TFs）全基因组结合图谱；基于反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）的体内基因敲低实验验证功能。样本来源包括Sgsh^-/-小鼠及野生型（wild-type，WT）对照，并在人脑组织数据集中进行验证。

**三、研究结果**

**1. Sgsh缺陷优先影响小胶质细胞的溶酶体形态和基因表达**
透射电镜显示Sgsh^-/-小鼠皮质中，具有小电子致密核的细胞（符合小胶质细胞特征）出现显著增大的电子透明空泡（>1000 nm），而神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞特征细胞仅见较小空泡或无空泡。分选的小胶质细胞EM分析证实Sgsh^-/-细胞空泡异常增多，细胞体积约为WT的2倍。免疫荧光显示Sgsh^-/-小胶质细胞CD68染色显著增加，胞体增大，初级突起长度缩短。snRNA-seq鉴定出小胶质细胞有超过530个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），远多于神经元和少突胶质细胞。

**2. Sgsh缺陷小鼠小胶质细胞基因表达的时间依赖性变化**
scRNA-seq显示83%的Sgsh^-/-小胶质细胞存在于具有疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia，DAM）/小胶质细胞神经退行性变（microglia neurodegenerative，MGnD）特征的MG1簇。bulk RNA-seq显示DEGs随时间进展增加：上调基因从3周龄的178个增至8月龄的708个。下调基因包括稳态标志物（P2ry12、Tmem119、Sall1），早期上调基因富含溶酶体途径（Apoe、Atp6v1a、Ctsb），晚期上调基因富含炎症途径（Clec7a、Lgals3、Cst7）。

**3. Sgsh缺陷主要影响小胶质细胞的表观遗传景观**
H3K27ac ChIP-seq鉴定出小胶质细胞约9,800个差异乙酰化区域，而少突胶质细胞约1,000个、神经元仅262个。约90%改变H3K27ac的ATAC-seq峰位于距启动子>3 kb处，表明主要影响通过远端增强子发生。DEG的log2FC与H3K27ac变化呈正相关（Pearson相关系数0.67）。

**4. 进行性染色质重塑将MITF/TFE因子鉴定为驱动因子**
时间序列H3K27ac分析显示差异区域从3周龄的1,896个增至8月龄的5,783个。基序富集分析发现，与协调溶酶体表达和调控（coordinated lysosomal expression and regulation，CLEAR）元件匹配的基序在诱导区域中高度富集，MITF/TFE家族成员被强烈暗示为关键驱动因子。

**5. Sgsh缺陷对MITF/TFE因子的细胞类型特异性后果**
ChIP-seq显示MITF、TFEB和TFE3在Sgsh^-/-小胶质细胞中结合显著增强。TFE3结合位点在启动子区域部分重叠，但远端增强子区域高度细胞类型特异性。小胶质细胞特异性增强子处TFE3结合位点富集CLEAR元件和小胶质细胞谱系决定转录因子（lineage-determining transcription factors，LDTFs）基序。

**6. MITF/TFE因子与稳态及应激响应转录状态的关联**
MITF/TFE结合增加与H3K27ac增强相关，但非所有结合增加位点均伴随增强子激活。基序共现分析表明，MITF/TFE基序的存在及与C/EBP、AP-1/ATF等因子基序的组合对增强子有效激活至关重要。

**7. Sgsh缺陷中MITF+TFE3缺失的分子后果**
ASO介导的Mitf+Tfe3联合敲低导致444个基因下调和482个基因上调。下调基因显著富集溶酶体途径，与Sgsh^-/-上调基因重叠；上调基因富集干扰素应答和MHC II类程序，表明MITF/TFE活性促进溶酶体基因表达同时抑制特定免疫模块。

**8. Sgsh^-/-小胶质细胞特征在年龄相关性神经退行性变模型和AD患者中观察到**
Sgsh^-/-小胶质细胞上调基因与APP/PS1小鼠的Clec7a^high淀粉样蛋白反应性小胶质细胞（AR-MG）和Tau/APOE4反应性小胶质细胞（TERM）显著重叠（8月龄时分别共享669和406个基因，270个基因三模型共有）。在AR-MG中观察到共享的染色质可及性区域。在人类数据集中，Sgsh^-/-特征在GPNMB-LPL群体（与AD病理相关的独特群体）中高度富集。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，Sgsh缺陷对小胶质细胞的比例失调效应表明小胶质细胞可能在疾病早期承担HS摄取和清除的补偿功能，当该功能被淹没时导致神经病理。MITF/TFE因子在体内细胞类型分辨的全基因组结合模式此前未被系统确定，本研究证实其结合位点由与细胞类型特异性LDTF的协同互作决定。Sgsh缺陷小胶质细胞特征与AD模型和人类患者的重叠表明，溶酶体应激的转录响应机制可能也参与年龄相关性神经退行性疾病的病理过程。MITF/TFE激活是否发挥神经保护或致病作用尚待明确，未来研究可能探索其治疗靶向潜力。

**研究结论**：本研究揭示了溶酶体功能障碍通过MITF/TFE转录因子家族与AP-1/ATF、C/EBP和PU.1/ETS等因子的协同作用，驱动小胶质细胞特异性的转录和表观遗传重编程，该程序在多种神经退行性疾病模型中保守存在，为理解溶酶体功能障碍与神经退行性变之间的联系提供了重要机制见解。