TCR来源及对不同抗原呈递细胞上环境或自身抗原的特异性决定外周Treg细胞分化

《Immunity》：TCR origin and specificity to environmental or self-antigens on distinct antigen-presenting cells determine peripheral Treg cell differentiation

　　

外周调节性T（pTreg）细胞的分化促进对绝对非己物质（如食物或共生微生物）的免疫耐受。研究人员利用基于CRISPR的TCR编辑技术，对原代T细胞进行一个大TCR组（TCR panel）的编辑，评估由自身、微生物或饮食抗原诱导的pTreg细胞分化，以此研究TCR识别与环境信号之间的相对重要性。所有抗原类别均驱动了稳定的pTreg细胞分化，该分化随TCR来源而变化：源自Treg细胞的TCR比源自常规T细胞的TCR更有效地促进pTreg细胞分化。识别自身、微生物或饮食抗原的TCR引发了不同的pTreg细胞表型：Helios⁺、RORγ⁺或两者兼有。不同的TCR-抗原对建立了不同的转录程序。这些差异追溯至所涉及的抗原呈递细胞（APC）类型——食物反应性TCR主要依赖于RORγ⁺ APC，而自身反应性TCR依赖于常规树突状细胞（conventional dendritic cells）。因此，TCR特异性是CD4⁺ T细胞命运和表型的主要决定因素，整合了抗原特异性和呈递背景，为设计基于TCR的耐受性免疫疗法提供了框架。

**论文解读：TCR起源与特异性决定外周Treg细胞分化**

**研究背景与问题**

肠道是机体与大量饮食抗原、共生微生物和自身抗原持续相互作用的复杂免疫环境。维持免疫稳态依赖于对非己抗原（如食物和微生物）的适当耐受。调节性T（Treg）细胞，尤其是表达FoxP3的Treg细胞，在抑制过度炎症和促进肠道耐受中起关键作用。Treg细胞可分为胸腺来源的tTreg细胞和外周诱导的pTreg细胞。传统观点认为，Helios⁺ Treg细胞多为tTreg，而RORγ⁺ Treg细胞多为pTreg，但近期研究显示两者存在共同前体，这一关系尚存争议。此外，微生物和饮食对肠道Treg细胞的影响是直接（抗原依赖）还是间接（通过代谢物等）？哪些因素决定常规T细胞（Tconv）转化为pTreg细胞？这些问题的核心在于TCR特异性是否预先编码了细胞的命运，以及不同抗原呈递细胞（APC）亚群在其中的作用。由于传统转基因小鼠模型可研究的TCR有限，这些问题难以回答。

**研究内容与结论**

研究人员通过对原始T细胞进行CRISPR-Cas9介导的TCR编辑，系统评估了源自结肠Treg和Tconv细胞的一组TCR（针对饮食、微生物和自身抗原）在诱导pTreg细胞分化中的能力。研究发现，TCR本身是决定CD4⁺ T细胞命运和表型的主要因素：Treg细胞来源的TCR比Tconv细胞来源的TCR更有效地驱动pTreg细胞分化；不同抗原类别的TCR诱导不同表型的pTreg细胞（Helios⁺、RORγ⁺或两者）；不同TCR-抗原对建立独特的转录程序；这些差异与涉及的APC类型密切相关——食物反应性TCR主要依赖RORγ⁺ APC，自身反应性TCR依赖常规树突状细胞（cDC），微生物反应性TCR则部分依赖两者。此外，pTreg细胞不仅存在于肠道相关淋巴组织（GALT），还广泛分布于脾脏等全身淋巴器官，并可在无抗原刺激下长期维持记忆。该研究发表于《Immunity》。

**关键技术方法**

研究人员主要采用CRISPR-Cas9为基础的TCR敲入系统，利用一种进化型腺相关病毒（AAV）变体Ark313，将编码目标TCRα和TCRβ链的序列整合到Cas9转基因小鼠原代CD4⁺ T细胞的Trac基因座中，同时失活内源TCR基因。通过体外共培养（使用不同抗原来源如热处理细菌、蛋白质提取物等）和体内转移（将TCR编辑的T细胞转入不同抗原条件的小鼠）实验，结合流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq），评估pTreg细胞分化、表型和转录组。样本队列来源于特定病原体自由（SPF）小鼠、无菌小鼠及单菌定植小鼠（如 *Clostridium ramosum* 和 *Escherichia coli* Nissle）。此外，还利用MHCII条件性敲除小鼠（MHCII^ΔRORγ和MHCII^ΔClec9a）鉴定不同APC的作用。

**研究结果**

**1. 结肠CD4 TCR被食物、细菌和自身抗原激活**
通过体外共培养和体内Nur77-GFP报告实验，研究人员从24个结肠CD4⁺ T细胞来源的TCR中鉴定出8个微生物反应性、9个食物反应性和5个自身反应性TCR。自身反应性TCR主要源自Helios⁺ Treg细胞，微生物反应性TCR源自Tconv或RORγ⁺ Treg细胞，食物反应性TCR则源自多种细胞类型。

**2. TCR-抗原识别决定T细胞命运和组织分布**
将TCR编辑的Tconv细胞转入不同抗原条件的小鼠，发现几乎所有TCR都驱动细胞优先在GALT积累，且依赖抗原存在。Treg细胞来源的TCR普遍能诱导pTreg细胞分化，而Tconv受限的TCR则基本不能。食物反应性TCR诱导pTreg细胞的能力最强，自身反应性TCR也能诱导，但效率较低。pTreg细胞首先在肠系膜淋巴结中出现，随后扩散至脾脏和肠道组织。

**3. pTreg细胞表型由TCR决定**
不同TCR-抗原对诱导的pTreg细胞呈现不同表型：微生物抗原主要诱导RORγ⁺ pTreg细胞，自身抗原诱导Helios⁺ pTreg细胞，食物抗原则诱导混合表型（RORγ⁺或Helios⁺）。RORγ⁺ pTreg细胞更易由源自RORγ⁺ Treg细胞的TCR诱导。食物抗原驱动的RORγ⁺ pTreg细胞分化不依赖微生物，但IL-6信号对RORγ表达至关重要。

**4. 不同抗原/TCR对诱导转录组独特的pTreg细胞**
scRNA-seq分析显示，表达不同TCR的pTreg细胞在UMAP上定位不同，食物反应性TCR（如TF2.2）的pTreg细胞主要富集于活化Treg（aTreg）细胞簇，表达高水平的 *Rorc*、*Ikzf2*、*Maf* 和 *Il10*；自身反应性TCR的pTreg细胞主要处于过渡簇；微生物反应性TCR的pTreg细胞分布更分散。未转化为FoxP3⁺的细胞处于过渡状态，表达与无能相关的基因（如 *Izumo1r*、*Nt5e*），表明pTreg细胞分化存在一个接近FoxP3诱导的阈值点。

**5. pTreg细胞是否作为记忆池持续存在？**
通过改变食物抗原暴露，研究人员发现食物特异性pTreg细胞在无抗原环境下可长期存在（6-10周），再次暴露抗原后数量恢复至持续暴露水平，表明pTreg细胞具有记忆特性。RORγ/Helios表型在无抗原刺激下可发生变化，尤其在微生物负荷高的组织（如结肠）中。

**6. 不同抗原来源依赖不同的APC**
利用MHCII^ΔRORγ和MHCII^ΔClec9a小鼠，研究人员发现食物反应性TCR诱导的pTreg细胞分化主要依赖RORγ⁺ APC，自身反应性TCR依赖cDC，微生物反应性TCR则部分依赖两者。不同APC不仅影响pTreg细胞数量，还影响其表型（RORγ⁺或RORγ^?）。

**总结与讨论**

研究结论表明，TCR特异性是CD4⁺ T细胞在外周分化为pTreg细胞及其表型的首要决定因素，它整合了抗原特异性和递呈环境。TCR预先编码了细胞命运，这通过TCR来源（Treg vs. Tconv）和识别的抗原类别（自身、微生物、食物）体现。该发现对TCR工程化细胞治疗具有直接意义：使用Treg细胞来源的TCR更有利于实现耐受性状态。研究的局限性包括：未知具体抗原肽及其剂量，不清楚TCR最初源自tTreg还是pTreg细胞，以及这些TCR是否正常情况下会被选择进入常规T细胞池。尽管如此，该研究为基于TCR的耐受性免疫疗法设计提供了框架。