环境诱导的细胞硬化通过调节癌细胞的免疫脆弱性来塑造转移部位选择

《Immunity》：Environmentally induced cell stiffening shapes metastatic site selection by tuning the immune vulnerability of cancer cells

　　

转移性微环境不仅在生化组成上差异很大，而且在力学特性上也差异很大。在此，研究人员探究了转移生态位的力学硬度如何影响转移灶的播种和抗肿瘤免疫监视的局部效果。癌细胞响应于环境硬度的增加而硬化，这种生物物理变化使它们在机械上对细胞毒性淋巴细胞的杀伤更敏感。在免疫缺陷小鼠中，癌细胞的硬度感应产生了强烈的骨定植，伴随着癌细胞本身的显著硬化。相反，在免疫健全的宿主中，更硬的癌细胞被选择性清除，骨转移受到抑制。在患者中，转移性细胞硬度与环境硬度直接相关，与免疫浸润呈负相关。编码分泌性糖蛋白骨桥蛋白（osteopontin）的Spp1的表达定义了在骨中扩增的一个癌细胞亚群，而Spp1的缺失限制了环境诱导的癌细胞硬化、骨定植和免疫脆弱性。因此，环境机械感应（mechanosensing）调节转移播种和抗肿瘤免疫，为转移部位选择提供了免疫学基础。

**论文解读：环境硬度通过机械互惠性与机械监视协同调控转移部位选择**

**一、研究背景与问题**

转移是癌症相关死亡的主要原因，转移性微环境呈现显著的生化与力学异质性。不同器官的硬度差异极大，例如肺和脑组织柔软，而矿化骨接近钢的硬度。粘附细胞（包括癌细胞）通过机械互惠性（mechanoreciprocity）与其环境持续进行生物力学串扰，表现为在硬环境中变硬、在软环境中变软。然而，这种力学适应对转移定植和抗肿瘤免疫的影响尚不清楚。同时，细胞毒性淋巴细胞（CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞CTL和自然杀伤NK细胞）通过免疫突触（immune synapse）识别并杀伤靶细胞，而免疫突触对靶细胞力学性质敏感——更硬的靶细胞更易被杀伤，这一过程称为机械监视（mechanosurveillance）。但机械互惠性与机械监视在转移部位选择中的相互作用从未被探索。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明环境硬度如何通过调控癌细胞力学特性影响转移位点选择及免疫监视效能。论文发表在《Immunity》。

**二、关键技术方法概述**

本研究综合运用了多种前沿技术。细胞力学测量采用原子力显微镜（AFM）和悬浮微通道谐振器（SMR），后者可高通量测定单细胞大小归一化声散射（SNACS）。体外杀伤实验使用OT-1 CTL和NK细胞与B16F10细胞共培养，通过流式细胞术和活细胞成像评估杀伤和细胞因子产生。体内转移模型采用尾静脉或心内注射，使用C57BL/6J野生型、穿孔素敲除（Prf1^-/-）小鼠，以及NK细胞或CD8⁺T细胞耗竭模型。皮下植入不同硬度（15% vs 30%聚丙烯酰胺）的水凝胶支架以构建独立于其他因素的力学微环境。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（Xenium平台）分析转移灶中癌细胞的转录谱和空间定位。CRISPR-Cas9技术敲除Spp1基因。人类样本来自Memorial Sloan Kettering癌症中心（MSKCC）的乳腺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）脊柱转移患者，分别分离骨和硬膜外区域的癌细胞进行SMR和免疫组化分析。

**三、研究结果**

**Environmental rigidity controls the stiffness and immune recognition of cancer cells**
通过将B16F10黑色素瘤细胞培养在不同硬度（8 kPa、50 kPa、~1 GPa）的基底上，AFM和SMR测量显示，细胞硬度随基底硬度增加而升高，证实了机械互惠性。将培养在较硬基底上的B16F10细胞与OT-1 CTL或NK细胞共培养，发现CTL产生的IFNγ和TNF增加，癌细胞杀伤率显著升高，表明环境硬度使癌细胞对细胞毒性淋巴细胞更敏感。

**Environmental rigidity sensitizes MTCs to cytotoxic lymphocytes in vivo**
尾静脉注射Luc⁺ B16F10细胞至免疫健全（WT）和Prf1^-/-小鼠，Prf1^-/-小鼠除了肺转移外，还出现明显的骨转移（股骨、脊柱、颅骨等），并导致后肢瘫痪。通过量化腿部/总生物发光比值，证实Prf1^-/-小鼠股骨转移选择性增加。NK细胞耗竭（而非CD8⁺T细胞耗竭）同样导致骨转移增强，表明NK细胞是主要效应细胞。皮下植入不同硬度的水凝胶支架，NK细胞耗竭后，癌细胞更倾向定植于硬支架，而对照组无明显偏好，说明环境硬度本身足以增强抗肿瘤免疫。

**Immune pressure and the microenvironment dictate MTC stiffness in mice and humans**
从WT和Prf1^-/-小鼠的肺和骨中分选GFP⁺ B16F10转移性肿瘤细胞（MTC），SMR测量显示：Prf1^-/-肺MTC硬度高于WT肺MTC，表明机械监视优先清除软细胞；Prf1^-/-骨MTC硬度显著高于肺MTC，表明骨微环境通过机械互惠性使细胞变硬。NK细胞耗竭实验得到类似结果。在人类脊柱转移样本中，乳腺癌骨转移MTC硬度高于硬膜外MTC，而NSCLC则相反。免疫组化显示NSCLC转移灶有大量CD8⁺和CD56⁺淋巴细胞浸润，而乳腺癌转移灶浸润较少，推测高免疫压力下机械监视逆转了机械互惠性效应。

**Spp1 expression defines a subset of bone colonizing MTCs**
对WT肺、Prf1^-/-肺和Prf1^-/-骨来源的B16F10 MTC进行scRNA-seq，UMAP聚类分析发现Prf1^-/-骨中富集了一个簇（cluster 7），该簇高表达Spp1（编码骨桥蛋白）。B16F10细胞在硬基底上培养产生更多骨桥蛋白。TCGA分析显示，Spp1扩增在硬组织来源肿瘤（如肉瘤）中更常见，缺失在软组织肿瘤（如胶质母细胞瘤）中更常见。空间转录组学（Xenium）进一步确认，Spp1-high黑色素瘤细胞与骨系细胞（osteolineage cells）共定位，且在骨基质附近具有更高的硬度评分。

**Spp1 controls cancer cell stiffness and mechanosurveillance**
CRISPR-Cas9敲除Spp1后，Spp1^-/- B16F10细胞硬度显著降低，F-actin含量减少，添加纯化骨桥蛋白可恢复硬度。体外杀伤实验显示，Spp1^-/-细胞对CTL的杀伤敏感性和CTL的细胞因子产生、脱颗粒均降低，且MHC I类分子表达正常，表明骨桥蛋白通过增加细胞硬度增强免疫脆弱性。体内免疫编辑分析显示，Prf1^-/-肺MTC的Spp1表达高于WT肺MTC，且Spp1^-/- MTC在WT和Prf1^-/-肺中硬度无差异，说明Spp1依赖的硬度变化是免疫选择的基础。在人类黑色素瘤scRNA-seq数据中，SPP1和细胞骨架基因表达在淋巴细胞浸润“absent”的肿瘤中最高，在“brisk”肿瘤中最低，与机械监视理论一致。

**Spp1 mediates mechanoreciprocity and bone colonization**
Spp1^+/+ B16F10细胞在硬基底上硬度增加，而Spp1^-/-细胞几乎无变化，表明骨桥蛋白是机械互惠性的关键介质。体内转移实验显示，Spp1^-/-细胞在WT和Prf1^-/-小鼠中均无法定植于骨，尽管在肺中正常生长。在去矿化骨纸（DBP）上培养的骨重建模型中，Spp1^-/-细胞形成集落的能力显著弱于Spp1^+/+细胞，确认骨桥蛋白促进骨微环境定植。空间转录组学显示Spp1-high黑色素瘤细胞与骨系细胞共定位，且硬度评分升高，表明两者在骨内膜生态位中发生机械互惠性相互作用。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，本研究整合生物物理、基因表达和体内模型，证明环境硬度通过机械互惠性和机械监视的耦合效应影响转移生长。骨桥蛋白是癌细胞来源的关键介质，对机械适应和免疫监视均至关重要。人类样本的转录组、生物物理和组织学分析证实了小鼠模型的机制同样适用于人类。研究还发现，机械适应性（而非静态机械记忆）是关键的可选择性状，Spp1通过促进癌细胞与骨基质粘附和响应，介导骨内膜生态位定植，但同时使其对免疫监视敏感。骨桥蛋白同时具有免疫抑制（通过CD44）和免疫刺激（通过机械硬化）双重作用，其净效应取决于环境硬度等背景因素。未来需通过机械解耦骨桥蛋白的免疫抑制和机械调节活性，以利用其免疫刺激优势。

研究结论：环境机械感应通过调节转移播种和抗肿瘤免疫，为转移部位选择提供了免疫学基础。机械互惠性使定植于硬环境的癌细胞变硬，从而被细胞毒性淋巴细胞优先清除；而Spp1的表达赋予癌细胞适应硬环境的能力，但同时也使其更易被免疫监视。这一机制解释了为何骨转移在免疫缺陷条件下更容易发生，并揭示了免疫系统在塑造转移部位分布中的关键作用。