髋关节骨关节炎中的肠道-关节轴

《JBJS Open Access》：The Gut-Joint Axis in Hip Osteoarthritis

　　背景：肠道菌群失调和微生物系统性移位可能加剧慢性关节炎症。不过，肠道-关节轴在骨关节炎发病中的作用仍有待阐明。本研究旨在分析髋关节内的分类特征及促炎代谢途径，以明确其在骨关节炎病理生理过程中的作用，并与无关节炎的对照组进行比较。

方法：本研究纳入了48名接受髋关节置换术的患者作为前瞻性队列研究。从原发性髋关节骨关节炎患者（20例）和股骨颈骨折患者（20例）中采集滑液、关节软骨以及髋臼窝组织样本。通过16S-rRNA基因测序（V3–V4区域）进行宏基因组分析。根据诊断类型（关节炎 vs. 骨折）及样本来源，比较了α多样性和β多样性、分类组成以及预测的功能途径（PICRUSt2）。

结果：与骨折对照组相比，骨关节炎样本的α多样性均匀度较低（p = 0.031）。虽然β多样性主要受样本类型影响而非诊断类型，但在属水平上存在显著的分类差异。假单胞菌、Atopostipes菌属和葡萄球菌在各组之间，无论从样本来源还是诊断类型来看，其丰度均存在显著差异。功能预测分析显示，骨关节炎样本中KDO2-脂质A生物合成途径明显富集，尤其是在假单胞菌属中。参与脂多糖生物合成与转运的关键基因，如lpxB、lpxL和lpxM，在骨关节炎关节中的中位丰度显著高于对照组（p < 0.00000001）。

结论：与无关节炎的对照组相比，髋关节骨关节炎患者存在特定的分类特征以及与脂多糖相关的代谢途径差异，这反映了非感染性炎症性关节环境中的微生物分子特征，尽管在群体层面并未出现由诊断类型带来的显著差异。

证据等级：诊断级III级。有关证据等级的详细说明，请参阅《作者指南》。

引言：近年来，微生物组在骨关节炎发病机制中的作用越来越受到关注。除了系统性影响外，最新研究还挑战了“滑膜关节为无菌环境”这一长期以来的观点。通过下一代测序技术，即使在没有明显感染的情况下，也在滑液和组织中检测到了微生物DNA。部分由肠道菌群失调引发的系统性炎症被认为会促进骨关节炎的发展，这一概念被称为“肠道-关节轴”。研究表明，肠道微生物组成的失衡——即菌群失调——可改变全身免疫反应，增加肠道通透性，促使微生物成分如脂多糖进入血液循环，从而引发关节炎症。虽然少量脂多糖通过门脉转移属于正常生理现象，但持续的全身暴露则会引发慢性低度炎症，这一机制在骨关节炎、类风湿性关节炎、肥胖症和炎症性肠病中也有体现。此外，肠道通透性还可能与关节置换术后并发症的发生有关，尤其是假体周围感染。

在健康关节和骨关节炎关节中都检测到了关节内的微生物群落，且骨关节炎患者的微生物特征具有特殊性。尽管这些研究主要针对膝关节，但关于髋关节的数据较为有限，仅有Goswami等人描述过髋关节的微生物群。此外，不同关节区域的微生物多样性和组成也可能存在差异，这反映了局部免疫反应、组织结构及代谢活动的不同。例如，拭子样本的微生物特征和丰度与组织样本及滑液样本存在差异，表明关节内的微生物群受位置因素的影响。

本研究的目的是分析骨关节炎患者与无关节炎对照组相比，髋关节不同区域的微生物群特征，进而识别出富集的促炎代谢途径，以明确其在骨关节炎关节炎症病理生理过程中的作用。我们假设，患有关节炎的髋关节与健康的髋关节相比，其微生物组特征存在差异。

方法
资金来源：本研究得到了2021年国际骨科与创伤外科协会（SICOT）的研究资助，同时也有机构转化医学与生物医学工程中心（IMTIB）的支持。基因测序工作在阿根廷国家农业技术研究院完成。

患者招募：这项前瞻性队列研究已获得机构伦理审查委员会批准（IRB00010193，方案编号#3372），共纳入48名在2021年12月至2022年6月期间在我院接受关节置换术的原发性髋关节关节炎或股骨颈骨折患者。那些曾接受过同一关节手术、有局部或全身感染迹象、患有炎症性关节炎或自身免疫性疾病、转移性疾病，或有静脉药物使用史的患者被排除在外。最初纳入的病例中有8例因病历不全被排除，最终有40例患者参与分析。根据导致关节置换的诊断类型，这些患者被分为两组：“骨关节炎组”（20例）和“股骨颈骨折组”（20例）。囊内型股骨颈骨折患者被作为对照组，因为先前的研究表明，患有此类骨折的老年人很少会发展成髋关节骨关节炎。实际上，有研究认为骨关节炎是对囊内型股骨颈骨折的一种保护因素，因为这类患者通常股骨颈的骨密度较高，而转子区的骨密度较低，这可能会增加他们发生囊外型骨折的风险。

所有“骨关节炎”患者都接受了全髋关节置换术，而“股骨颈骨折”患者则根据术前功能状况，分别接受了半髋关节置换术（12例）或全髋关节置换术（8例）。研究人员收集了包括饮食习惯以及在过去12个月内是否有过向关节内注射皮质类固醇或其他药物的历史等人口统计学数据（见表I）。与以往建议一致，所有择期手术患者都被要求在手术前1个月戒烟。慢性疾病则通过Charlson合并症指数进行分类。术前改良Harris髋关节评分和Parker活动能力评分被用于评估患者的术前功能状况。

表I：研究对象的人口统计学特征
总计N = 40
股骨颈骨折组n = 20
骨关节炎组n = 20

性别比例（%）
女性30（75%） 19（95%） 10（50%） p = 0.003

年龄（岁，标准差）75.50（16.67） 85.20（8.35） 68.80（13.54） p = 0.001

体重指数（kg/m2，标准差）26.83（5.82） 26.79（4.46） 27.95（5.13） p = 0.450

体重（公斤，标准差）70.63（17.88） 65.39（12.78） 78.53（16.57） p = 0.008

身高（米，标准差）1.60（0.26） 1.60（0.08） 1.68（0.10） p = 0.006

Charlson评分（标准差）4.18（2.23） 5.70（1.59） 2.75（1.86） p = 0.000

糖尿病患病率3（7.5%） 2（5%） 1（2.5%） p = 0.367

纯素食或素食者比例000 N/A

吸烟者7（17.5%） 4（20%） 3（15%） p = 0.365

种族白人40（100%） 20（100%） 20（100%） N/A

术前改良Harris髋关节评分（标准差）69.47（7.23） 69.10（6.90） 69.85（7.70） p = 0.747

术前Parker活动能力评分（标准差）7.00（1.71） 6.25（1.97） 7.75（0.97） p = 0.005

手术时间（分钟，标准差）54.55（14.21） 56.10（15.20） 53.00（13.36） p = 0.498

样本从采集到存放在实验室的时间（分钟，标准差）34.33（11.11） 37.60（10.81） 31.05（10.67） p = 0.061

术后假体周围感染发生率（%）1（2.5%） 01（5%） p = 0.329

死亡率（%）0.15（0.36） 0.15（0.37） 0.15（0.37） 1.000

手术特征与样本采集：所有手术均在层流手术室中通过后外侧入路进行。所有患者都在手术前使用了1克氨甲环酸。手术部位用标准的碘伏和酒精混合溶液进行消毒，所有手术都使用了浸有碘的无菌手术单（3M Ioban）。没有患者对碘伏溶液过敏。所有操作均严格遵循机构的标准化清洁和灭菌流程。样本来自滑液、软骨和髋臼窝。在切开关节之前，使用18号针头抽取至少2毫升的滑液。为了避免温度对检测结果的影响，还使用16号刀片从股骨头软骨和髓凹处采集了约4立方毫米的深层组织样本。总共采集了120个样本。选择这些采样部位是因为它们与关节微生物群和局部炎症密切相关，而髋臼窝样本的加入则是由于髓凹在炎症反应、免疫调节和干细胞活性方面起着重要作用。所有样本都被放入无菌容器中，储存在-80℃条件下。

DNA提取、扩增与测序：通过16S-rRNA基因测序对样本进行宏基因组分析。DNA提取采用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit，不同类型的样本提取出的DNA浓度有所差异。由于16S-rRNA基因的V3–V4超变区具有较高的分类分辨率，能够有效区分不同的微生物物种，因此选择该区域进行扩增。测序则采用Illumina技术进行。

统计、生物信息学分析及结果评估：首先对配对末端序列进行解复用，然后导入QIIME 2（v2024.2）软件中。经过质量检测后，再使用DADA2工作流程处理序列，生成高分辨率的扩增子序列变异体以及特征表。这些序列变异体会被比对，进而通过MAFFT/FastTree工具构建出有根系的系统发育树。分类分析则借助基于SILVA-138数据库（515F/806R区域）训练的朴素贝叶斯分类器完成。那些总读取数少于5次的序列变异体以及测序深度低于1,000次的样本都被排除在外。在开展多样性和丰度分析之前，还会去除未分类的、真核生物的、线粒体的、叶绿体的序列以及环境污染物。

多样性分析方面，采用了Shannon、Simpson、Chao1以及观测特征指数来评估α多样性，组间比较则使用Kruskal-Wallis检验。β多样性则通过Bray-Curtis、Jaccard以及加权和非加权UniFrac距离指标来衡量。社区结构通过主坐标分析进行可视化，而组间差异则通过根据样本类型和诊断类型进行的PERMANOVA分析来判断。微生物特征分析是在R软件（v4.4.2）中完成的，该分析将分类注释与序列变异体丰度相结合。相对丰度的差异则通过带有Benjamini-Hochberg校正的Wilcoxon秩和检验来确定。门水平和属水平的组成则通过堆叠柱状图展示。

基于16S-rRNA分类特征的功能预测，则用于估算与细菌核心功能相关的KEGG同源基因的相对丰度，这些功能包括主动运输、膜脂生物合成、对环境压力的适应反应以及营养物质吸收等。功能推断则基于16S-rRNA V3–V4序列变异体，使用PICRUSt2工具，并结合KO数据库中的信息来标注各基因的丰度。分析重点关注与炎症相关的脂多糖的生物合成、组装和转运途径。不同临床状态下这些基因丰度的差异则通过Wilcoxon秩和检验来评估。

伦理审查说明：本研究已获得REB批准的伦理审查编号IRB00010193，方案编号为3372。所有参与研究的个体都签署了知情同意书。作者确认，所有参与者都知晓研究目的并自愿同意研究成果被发表。

结果
人口统计学特征：表I展示了研究对象的人口统计学基本信息。所有参与者都不是纯素食者或素食者，且均为白种人。

测序、处理与分类鉴定：120个样本中有59个获得了高质量的测序数据，其中包括15份滑液样本、6份软骨样本和38份关节软骨样本。每个样本的平均测序深度为14,355次读取，范围在3,268到108,958次读取之间。经过序列去噪处理后，共得到4,372个扩增子序列变异体，其平均长度约为440碱基对。在排除了深度较低的样本以及一些污染性微生物类群——包括绿弯菌门、浮霉菌门、蓝细菌门、氢化菌门和马西利亚菌门——之后，最终确定了研究数据集。由于只有2份软骨样本符合所有筛选标准，因此这些样本未被纳入后续的统计分析中。

多样性分析：在Shannon指数、Simpson指数、观测特征指数以及Chao1指数中，不同样本类型的α多样性均无显著差异（分别为H = 2.38，p = 0.12；H = 2.07，p = 0.15；H = 1.73，p = 0.19；H = 1.73，p = 0.19，见图1-A）。按诊断类型分类后，只有Simpson指数存在显著差异，骨关节炎样本的多样性均匀度更低（H = 4.66，p = 0.031，见图1-B）。

多样性分析：图1显示了所采集样本的多样性特征。图1-A为不同样本类型的α多样性，比较指标包括Shannon指数、Simpson指数、观测特征指数和Chao1指数。图1-B则根据诊断类型显示α多样性，A和B图中的比较都是通过Kruskal-Wallis检验完成的。图1-C为β多样性分析结果，展示了使用Bray-Curtis、Jaccard、加权UniFrac和非加权UniFrac距离计算得到的PERMANOVA伪F值，星号表示具有统计学显著性。图1-D为基于Bray-Curtis距离的主坐标分析结果，用于比较不同样本类型（软骨 vs. 滑液）以及不同的临床状况（骨折 vs. 骨关节炎）。其中CA代表软骨，PCoA为主坐标分析，SF代表滑液。

β多样性在不同样本类型之间也存在显著差异，无论是通过Bray-Curtis距离、Jaccard距离、加权UniFrac距离还是非加权UniFrac距离，其伪F值均显示出显著差异（分别为伪F = 2.19，p = 0.001；伪F = 1.82，p = 0.001；伪F = 4.68，p = 0.001；伪F = 1.55，p = 0.017，见图1-C和图1-D）。而按诊断类型划分时，各类β多样性指标均无显著差异。

分类组成：在门水平上，变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门的丰度在不同样本类型之间存在显著差异，其他门类的丰度则无显著变化（见图2-A）。按诊断类型分类后，只有变形菌门和厚壁菌门的丰度存在显著差异（见图2-B和图3-A）。图2-C：按样本类型划分的主要微生物属的相对丰度（软骨组与滑液组）。图2-D：按临床状况划分的主要微生物属的相对丰度（骨折组与骨关节炎组）。CA=软骨，SF=滑液。打开多媒体模式。图3：打开多媒体模式。相对丰度曲线图。箱线图显示相对丰度，点代表单个样本。图3-A：骨折组与骨关节炎组对比。图3-B：软骨组与滑液组对比。比较采用Wilcoxon秩和检验，p值通过Benjamini-Hochberg方法进行调整。CA=软骨，SF=滑液。在属水平上，20种最丰富的菌属中，有7种的丰度因样本位置不同而存在显著差异：假单胞菌（p = 1.93 × 10^-19）、葡萄球菌（p = 2.61 × 10^-12）、Atopostipes属（p = 6.55 × 10^-4）、Enhydrobacter属（p = 0.025）、棒状杆菌属（p = 0.031）、鞘氨醇单胞菌属（p = 0.037）以及微球菌属（p = 0.041）（图2-C）。按诊断类型划分的差异仅限于假单胞菌（p = 4.56 × 10^-8）、Atopostipes属（p = 2.02 × 10^-6）和葡萄球菌（p = 0.033）（图2-D和图3-B）。代谢特征分析中最具代表性的同源基因是K03088（rpoE），它编码一种对包膜应激调节起关键作用的细胞外功能σ因子。此外，ABC型转运系统组分（K01990、K01992、K02003、K02004）、铁吸收渗透酶（K02014–K02016）、参与脂肪酸生物合成的酶（K00059、K00626），以及如galR（K02529）和mcp（K03406）这样的调控或感应蛋白也表现出较高的丰度。功能分析还发现了与LPS的生物合成、组装和运输相关的基因缺失，包括脂质A生物合成基因（K02535–K02542）、核心寡糖组装基因（K03273–K03278）、O抗原生物合成基因（K02845–K02848）以及LptA–G输出系统基因（K09694–K09700），还有参与LPS成熟过程的辅助基因（K00748、K00973、K03271）。对革兰氏阴性菌属的功能分析显示，骨关节炎样本中KDO2-脂质A生物合成途径显著富集。具体而言，与对照组相比，假单胞菌中K00748（LpxB）、K02535（LpxL）、K02536（LpxM）和K00973的中位丰度显著更高，p值小于1 × 10^-8，而这些同源基因在对照组中几乎不存在。这些结果表明骨关节炎关节中存在明显的促炎代谢潜力。相反，如不动杆菌和罗丝单胞菌等菌属的中位丰度p值大于0.05，说明其功能上无显著差异。同样，韦永氏菌、Atopostipes属、鞘氨醇单胞菌或Enhydrobacter属也未出现显著变化（图4）。打开多媒体模式。图4：按细菌属和临床状况分层的与革兰氏阴性菌相关的基因缺失丰度热图。讨论本研究为了解骨关节炎髋关节与非关节炎对照组的微生物组成提供了新视角，强调了关节内微生物群在关节健康中的作用。此外，该研究还为解读“无菌”髋关节的下一代测序结果提供了基础框架，有助于评估疑似人工关节感染的患者。尽管先前的研究表明，在初次全髋关节置换术中检测到阳性菌落可能预示着需要再次手术的可能性，但目前尚不清楚这是由于手术过程中皮肤微生物群的污染，还是真正存在关节内微生物群，因为大多数再次手术都是由于无菌性原因。因此，与Goswami等人的研究结果一致，我们确认了髋关节中存在独特的本土微生物群。不过，这种微生物群在未来人工关节失效时是否会产生影响——无论是由于感染还是无菌性原因——仍有待证实。虽然这些发现的临床意义尚需进一步阐明，但在不同临床条件下分析本土关节中的微生物DNA特征，有助于更好地理解关节微环境。群体层面的多样性指标可提供微生物组结构的整体概览，应视为探索性数据。在我们的研究中，不同样本类型的α多样性没有显著差异，表明滑液样本和软骨样本的丰富度和均匀性相当。在比较不同诊断类型时也观察到了类似的结果，只有辛普森指数除外，该指数显示骨关节炎样本的均匀性低于对照组。这一单独的发现表明，骨关节炎样本中某些类群的占比可能有所增加，尽管整体α多样性变化并不明显。β多样性则因样本类型而异，但与诊断类型无关，这说明解剖位置对关节内微生物群结构的影响比骨关节炎状态本身更为显著。相反，与骨关节炎相关的特征似乎更具选择性，涉及特定的分类学差异以及脂多糖相关通路的预测性功能富集，而非关节内微生物组的大规模重构。虽然大多数针对关节的研究仅分析了滑液中的微生物群，但本研究还分析了软骨和髓核组织。Goswami等人也进行了组织采样，分析了从膝关节置换术中的滑膜、胫骨和股骨，或髋关节置换术中的滑膜、髋臼和股骨取得的深层组织样本（2毫米3）。此外，还从膝关节置换术中的股骨和胫骨的骨髓腔，或髋关节置换术中的股骨和髋臼获取了拭子样本。然而，关节位置似乎并未影响细菌的分布。相反，我们发现样本位置显著影响了微生物的存在，这一点从β多样性中可以看出，从而为样本解读提供了相关的微生物学数据。Goswami等人报告称，大肠杆菌、Cutibacterium属、葡萄球菌、不动杆菌和假单胞菌是关节炎关节中最常见的5种菌属，其中大部分属于变形菌门。在他们的研究中，医院所在地（即不同的参与中心）而非人口统计因素与细菌组成的β多样性存在显著关联。在我们的研究中，分类学分布也显示出组间差异，与非关节炎对照组相比，关节炎组中假单胞菌更为常见。尽管在由微生物驱动的关节炎模型中，假单胞菌与关节炎症有关，但其存在并不能证明存在感染，而可能只是免疫激活的异常局部表现。在膝关节中，已有研究报道变形菌门的丰度显著较高，而变形菌门此前就被认为是肠道和非肠道组织中菌群失调的关键因素。此外，之前的肠道微生物组下一代测序分析也发现，与非关节炎对照组相比，变形菌门与膝关节骨关节炎有关。在骨折组中更为常见的葡萄球菌和Atopostipes属，也与系统性炎症/免疫疾病中的肠道菌群失调有关。Fernández-Rodríguez等人发现，在与关节炎对照组相比，无菌、非骨关节炎的膝关节中，葡萄球菌等物种更为占优势，这体现了不同微生物群特征的差异。这一发现与我们观察到的在股骨颈骨折病例（即非关节炎对照组）中这类微生物群更为常见的现象一致。功能分析显示，骨关节炎组和骨折组之间的基因缺失丰度存在显著差异，这部分是由假单胞菌导致的。骨关节炎样本中，与LPS生物合成和输出相关的基因表达更为丰富，包括lpxB（K00748）、lpxL（K02535）、lpxM（K02536）以及KDO2-脂质A生物合成途径中的相关同源基因（M00060）。LPS是强烈的炎症信号通路激活剂，包括TLR4/NF-kB通路，这些通路与滑膜炎症和软骨降解有关。这与“准无菌性炎症”的概念相符，即持续接触微生物成分会在没有明显感染的情况下导致慢性关节炎症。Gleason等人和Chisari等人强调了肠道菌群失调对系统性炎症及其对关节健康影响的机制，包括 Firmicutes/Bacteroidetes比例升高和LPS水平上升，进而导致骨关节炎进展。虽然这些观察结果与关于肠道-关节轴的新兴假说相一致，但还需要进一步研究来确定其中的因果关系及临床意义。本研究也存在一些局限性。首先，40名患者的样本量可能无法完全反映更广泛人群中的微生物组多样性，也限制了进行基于年龄或性别等人口统计因素的亚组分析的能力。其次，虽然16S-rRNA测序能够有效识别细菌，但它无法检测到其他可能导致骨关节炎的微生物。鸟枪法宏基因组学可以提供更全面的分类学和功能信息，但这超出了本研究的范围和资源限制。第三，本研究分析的是低生物量的关节内样本，这类样本容易受到污染。尽管采用了标准化的无菌操作流程，但仍无法完全避免污染。一些被检测到的菌属，如假单胞菌和葡萄球菌，已被报道可能是测序流程中的潜在污染物。因此，这些菌属不应被视为活细菌或活跃定植的证据，而只是微生物DNA特征，其生物学意义需要通过鸟枪法宏基因组学、微生物存活率检测以及多种组学方法来验证。第四，横断面设计限制了确定微生物DNA特征与骨关节炎进展之间时间或机制关系的能力。此外，所描述的功能特征是基于16S-rRNA数据预测的基因含量，因此反映的是微生物的代谢潜力，而非实际的蛋白质表达或转录组活性。骨关节炎的特点是存在慢性炎症微环境，因此，某些微生物DNA特征可能反映了长期宿主-微生物相互作用的累积效应，而非疾病发生的直接原因。从微生物学的角度来看，微生物DNA在关节组织中的持续存在可能是由多种并非互斥的过程造成的，包括接触微生物衍生的分子、低水平的微生物转移，以及随着时间推移微生物产物的清除机制发生改变。最后，本研究仅分析了关节样本，未对同一患者的肠道样本进行同步分析。总之，本研究在骨关节炎和正常髋关节中发现了可检测的微生物DNA特征，且这些特征因关节内样本位置的不同而存在显著差异。骨关节炎与某些分类学差异以及脂多糖相关通路的预测性富集有关，而非由广泛的诊断因素导致的关节内微生物组大规模重构。这些初步发现为进一步研究髋关节骨关节炎中的肠道-关节轴提供了依据，但并未确立微生物特征在骨关节炎发病机制中的因果作用。附录：HIBA髋关节外科团队费尔南多·康巴医学博士（骨科医生）、赫拉尔多·扎诺蒂医学博士（骨科医生）、卡洛斯·M·卢塞罗医学博士（骨科医生）（阿根廷布宜诺斯艾利斯意大利医院“卡洛斯·E·奥托伦吉”骨科研究所“约翰·查恩利爵士”髋关节外科团队）。