SLC10家族成员钠依赖性胆汁酸转运的结构洞察

《Structure》：Structural insight into sodium-dependent bile acid transport by members of the SLC10 family

　　

人类顶膜钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT）和Na⁺依赖性协同转运多肽（NTCP）是来自SLC10家族的次级转运蛋白。这些具有9个跨膜螺旋的蛋白在胆汁酸的肠肝循环中发挥关键作用。研究人员在此解析了一个细菌同源物的晶体结构，该同源物同样具有9个跨膜螺旋且与人类ASBT具有高序列同源性。研究人员报告了该细菌同源物在内向状态下的两种不同结构，以及一种人源化变体在外向状态下（有和无胆汁酸结合）的结构。NTCP的结构显示存在一个贯穿蛋白的孔道，这违反了经典的交替访问机制。在研究人员解析的结构中，柔性的TM6封闭了这个孔道，表明在该9-跨膜螺旋蛋白家族中，外向封闭结构并非必然不存在。细菌和人类蛋白的分子动力学模拟强调，虽然胆汁酸底物锚定在转运蛋白中心的残基上，但周围膜中的脂质会与疏水性甾醇基团相互作用。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
胆汁酸是脂质和脂溶性维生素吸收所必需的物质，在肝脏中由胆固醇合成并经胆管释放至肠道，随后通过门静脉重吸收回肝脏。这一过程依赖多种膜转运蛋白，包括SLC10家族的顶膜钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT）和钠依赖性协同转运多肽（NTCP）。ASBT位于回肠，其抑制剂曾被开发为降胆固醇药物，后因疗效问题被重新用于治疗肠道和胆汁淤积性肝病；NTCP位于肝细胞，负责从门静脉摄取胆汁酸，同时被乙型肝炎病毒劫持作为进入受体。此前，SLC10家族的结构信息主要来自两个10跨膜螺旋的细菌同源物（ASBT_NM和ASBT_YF），它们呈现内向和外向两种构象，遵循交替访问机制。然而，近期通过冷冻电镜解析的人类NTCP结构显示，其外向构象中存在一个贯穿蛋白的开放孔道，这违反了经典的交替访问机制（即底物结合位点不应同时从膜两侧可及）。尽管多个研究组使用不同抗体/纳米抗体、去垢剂和纳米盘均得到相似的开孔结构，但该现象是否适用于具有9个跨膜螺旋的人类ASBT及其他SLC10家族成员尚不清楚。因此，研究人员旨在通过解析一个与人类蛋白同源且同样仅有9个跨膜螺旋的细菌同源物结构，来阐明该家族的转运机制。

**研究内容与结论**
研究人员从Leptospira biflexa中发现了一个细菌同源物ASBT_LB，其与人类ASBT具有32%的序列同一性且预测具有9个跨膜螺旋。通过脂立方相（LCP）结晶法，研究人员解析了野生型ASBT_LB的内向状态结构（2.2 ?分辨率），以及引入10个人源化突变（ASBT_LB10mut）后的外向状态结构（2.6 ?分辨率），并进一步获得了外向状态下结合脱氧胆酸（DCA）的结构（2.5 ?分辨率）。所有结构中钠离子结合位点清晰可见。与人类NTCP不同，ASBT_LB的外向构象中，TM6紧贴核心结构域，封闭了内向侧的孔道，从而避免了开放孔道的出现。分子动力学模拟表明，DCA的羧酸基团通过氢键稳定锚定在Thr82和Ala83处，而疏水性甾醇部分则与周围膜脂发生相互作用，形成蛋白-脂质共同介导的底物结合模式。模拟还显示，在内向和外向构象转换过程中，核心结构域和面板结构域均相对于膜发生移动，且两者之间相对位移约6 ?。进一步对基于ASBT_LB结构建模的人类ASBT进行模拟，验证了相似的结合特征。该研究揭示了SLC10家族成员可能采用不同的转运机制：ASBT_LB（以及推测的人类ASBT）通过TM6的柔性实现经典交替访问，而人类NTCP则可能利用瞬时开放孔道。论文发表在《Structure》。

**关键技术方法**
1. **脂立方相（LCP）结晶法**：用于膜蛋白ASBT_LB及其突变体的结晶，获得高分辨率X射线衍射数据。
2. **X射线晶体学**：解析野生型、突变体及底物结合态的多个结构，分辨率介于2.2–2.9 ?。
3. **分子动力学（MD）模拟**：使用CHARMM36全原子力场，在POPC/POPG脂双层中模拟ASBT_LB、ASBT_LB10mut及基于结构建模的人类ASBT，时长各1 μs，三重复，分析底物结合与脂质相互作用。
4. **AlphaFold2结构预测**：用于预测人类ASBT的内向和外向构象，并与实验结构比较。
5. **荧光热稳定性检测（CPM法）**：评估胆汁酸对蛋白稳定性的影响。

**研究结果**

**Structure of ASBT_LB in the inward-facing state**
通过GFP筛选从Leptospira biflexa鉴定出ASBT_LB，并利用LCP结晶解析了其内向状态结构（2.2 ?）。该结构包含9个跨膜螺旋，核心结构域由TM2、3、4、7、8、9组成，面板结构域由TM1、5、6组成。钠离子结合位点清晰：Na1由S84、N85、S98、T102、E233及S98的主链羰基氧八面体配位；Na2由Q47、Q237及E233、T234、I236的主链羰基氧四方锥配位，与ASBT_NM相似。另一晶型（2.9 ?）显示TM6在Gly168和Gly172处发生弯曲，增大内向侧腔的侧向开口，伴随TM1的协同移动。

**Structure of ASBT_LB with selected humanizing mutations in the outward-facing state**
引入10个突变（V14L、T83A、T206P、I236M、G239T、P240Q、I243S、A266S、V269Q、P270L）后，蛋白结晶为外向构象（2.6 ?），内向侧出口被封闭，外向侧出现裂隙。面板结构域相对于核心结构域旋转约22°，并沿平行于TM7的轴平移5 ?。钠离子结合几何与内向状态高度一致。TM6保持较直构象，与内向状态的不同晶型相似。

**Structure of ASBT_LB10mut with deoxycholic acid**
在结晶溶液中加入DCA后，获得外向状态结合DCA的结构（2.5 ?）。DCA位于外向侧TM1和TM5之间，其羧酸基团靠近核心结构域的交叉区，与Thr82的主链氮和羟基氧形成氢键；12位羟基氧通过水分子与Ser124和Asn238相互作用。DCA的甾醇环指向胞外。与未结合结构相比，除TM1 N端轻微扭转和TM6后连接区位移外，蛋白构象变化极小。DCA的定位与人类NTCP中模拟的甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）位置不同，但与抗HBV肽Bulevirtide的结合位点重叠。

**Comparison with AlphaFold models of hASBT**
AlphaFold2预测的人类ASBT内向结构与ASBT_LB内向结构高度吻合（RMSD 1 ?）。预测的外向结构中，TM6位置更接近ASBT_LB10mut而非人类NTCP，内向侧同样封闭，无开放孔道。而对于人类NTCP，AlphaFold2预测的TM6则比实验冷冻电镜结构更开放。

**Molecular dynamics**
全原子MD模拟（1 μs，三重复）显示：在外向状态中，DCA维持晶体结合构象，羧酸基团与Thr82和Ala83形成氢键，甾醇部分与膜脂频繁接触，结合位点仅从胞外侧可及。在内向状态中，DCA的甾醇部分转向胞内侧，但羧酸基团仍锚定于Thr82和Ala83，结合位点转为从胞内侧可及。疏水相互作用在内外向状态间几乎完全不同，仅Thr82和Gln240共有。脂质直接参与DCA甾醇部分的结合，形成蛋白-脂质共同底物结合位点。对基于结构建模的人类ASBT的模拟同样验证了Thr110（对应Thr82）锚定羧酸基团及甾醇与脂质相互作用的模式。此外，域位移分析表明，在内外向转换中，核心域和面板域均相对于膜中心发生约3 ?的平移，且两者相对位移约6 ?，不支持某一域特异性锚定于膜的假说。

**讨论与结论**
讨论部分总结了经典交替访问机制与SLC10家族的关系。先前基于ASBT_YF的结构提出该家族采用升降机机制，但人类NTCP的开孔结构对此提出了挑战。本研究中，ASBT_LB的外向结构因TM6封闭而符合经典交替访问，且TM6的柔性（围绕两个甘氨酸残基）允许瞬时开孔的可能性。钠离子通过稳定交叉区构象塑造底物结合位点，而DCA的羧酸基团锚定于Thr82，甾醇部分与膜脂相互作用，形成蛋白-脂质共同介导的结合模式，这可能解释为何具有庞大疏水基团的底物仍能被转运。虽然MD模拟暗示脂质参与结合，但尚缺乏中间态结构或完整转运轨迹来证明脂质是否参与转运过程。此外，结合AlphaFold2预测和MD模拟，人类ASBT可能采用与ASBT_LB相似的封闭外向构象，而人类NTCP的开放孔道可能仅是一种瞬时状态。因此，SLC10家族成员可能采用不同的转运机制：有的使用经典封闭机制，有的使用开放孔道机制。

**研究结论**：综合所有数据，支持交替访问机制，内外向状态之间的能垒较小。该机制不一定涉及如人类NTCP中看到的穿过蛋白的孔道，尽管TM6的柔性意味着孔道可以瞬时开放。钠离子通过稳定交叉区构象塑造结合位点，底物随后与交叉区残基相互作用，其甾醇部分与周围脂质相互作用。这种蛋白-脂质共同作用可能解释了具有庞大疏水基团的底物如何结合并被转运。