精简拼接冷冻电子断层扫描技术用于探索细胞与组织的超微结构

《Structure》：Streamlined montage cryo-electron tomography for exploring the ultrastructure of cells and tissues

　　

冷冻电子断层扫描技术（cryo-electron tomography, cryo-ET）能够在分子分辨率下揭示生物样本的架构，但其视野（field of view, FOV）有限。拼接断层成像（montage tomography）克服了这一限制，但现有策略依赖于复杂的剂量分布成像方案或硬件改造，阻碍了该方法的广泛采用。为降低入门门槛，研究人员开发了通过精简采集与冷冻断层图整合实现拼接的方法（montaging via streamlined acquisition and integration of cryotomograms, MOSAIC），这是一种简化的工作流程，与传统图像采集的偏差极小，并利用研究人员的软件MontageMaker合并重叠的倾斜序列。由此产生的拼接断层图以高通量生成，尽管剂量累积不均匀，仍保留了纳米级细节，并且易于在多种生物样本上采集。最重要的是，任何能够进行自动化cryo-ET数据采集的实验室都可以立即实施这种方法。

**精简拼接冷冻电子断层扫描技术：探索细胞与组织超微结构的新途径**

**研究背景与问题**

冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）是结构生物学领域中一种独特的技术，能够在接近天然状态下表征生物样本的超微结构。该技术虽然能够以亚纳米分辨率解析蛋白质结构，但其最大的优势在于揭示中尺度（mesoscale）细胞架构，并将高分辨率结构置于其生物学背景中。然而，cryo-ET在成像过程中使用的高放大倍数导致其视野（field of view, FOV）严重受限。虽然理论上可以通过降低放大倍数来扩大视野，但由此产生的大像素尺寸会掩盖使cryo-ET具有价值的高分辨率细节。拼接断层成像（montage tomography）技术通过在感兴趣区域采集多个重叠的倾斜序列并进行计算合并，生成单一的“拼接”断层图，从而解决了这一问题。

然而，现有的拼接断层成像策略存在诸多障碍。首先，历史上的拼接断层成像主要应用于树脂包埋样本，因为冷冻保存样本对辐射敏感，且重叠区域存在剂量累积的风险。近期有两项研究采用了复杂的成像方案来避免这些剂量“热点”，但这些方案依赖于SerialEM软件的自定义功能，而其他广泛使用的软件（如ThermoFisher Scientific的Tomography 5）不具备这样的控制能力。另一种替代方案是使用方形电子束，但圆形束是现有仪器中成熟的标准，采用方形束孔径需要对功能正常且昂贵的显微镜进行改造，令许多用户望而却步。此外，目前用于拼接的定制脚本往往针对特定工作流设计，缺乏普适性。总体而言，尽管上述方法能够成功生成拼接断层图，但该技术仍然难以执行，且很少被使用。因此，研究人员旨在提供一种更简单的解决方案，以帮助那些希望从断层扫描数据中获得更大视野的研究者。

**研究内容与结论**

为解决上述问题，研究人员建立了通过精简采集与冷冻断层图整合实现拼接的方法（montaging via streamlined acquisition and integration of cryotomograms, MOSAIC），该方法采用低剂量成像和研究人员开发的软件MontageMaker进行后续拼接。研究结果表明，这种方式进行的拼接断层成像操作简便，但能生成大型断层图，有助于探索细胞景观。该研究论文发表在《Structure》期刊上。

**关键技术方法**

研究人员开发了MontageMaker，这是一个基于MPACT工作流中BlendStitch脚本的图形用户界面应用程序，利用IMOD的核心功能进行拼接。MontageMaker可以连续合并多个拼接图，实现高通量处理，且不受采集软件或成像方案的限制。在图像采集方面，研究人员采用低剂量策略（每张切片约80 e^?/?²），摒弃了复杂的剂量均匀分布方案。研究还使用了TomoGrapher进行倾斜序列模拟，并利用子断层图平均（subtomogram averaging）技术评估图像质量。样本包括10T1/2成纤维细胞、A-431上皮细胞、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及小鼠（BALB/c）比目鱼肌组织。

**研究结果**

**MontageMaker实现高通量拼接断层图合并**

MontageMaker作为图形用户界面应用程序，仅需Python（包括Pillow、NumPy和mrcfile三个库）和IMOD即可运行。该软件能够自动检测并导入包含倾斜序列的子目录，用户可组织队列和拼接图瓦片的排列。软件通过互相关自动确定每张图像的近似重叠度，并使用IMOD的newstack和blendmont功能完成拼接。该软件可在Mac和Linux系统上运行，从高性能计算集群到个人笔记本电脑均可使用。

**降低剂量避免大规模损伤**

研究人员通过TomoGrapher模拟比较了MOSAIC（不均匀剂量分布）与MPACT（均匀剂量分布）两种成像方案。结果表明，尽管MOSAIC方案在局部区域有更高的最大剂量，但整个拼接图区域的累积剂量几乎相同。在实际成像中，研究人员发现使用典型剂量（约140 e^?/?²）会导致气泡现象，因此将剂量降至每张切片80 e^?/?²。该策略在所有测试的采集方案中均避免了明显的损伤迹象，生成的倾斜序列和重建的拼接断层图无缝，且保留了足够的细节以识别微管、核糖体和膜等细胞质组分。

**高剂量大拼接图中高分辨率信息损失**

研究人员通过对成纤维细胞核糖体进行子断层图平均来精确测量信息保留情况。结果表明，重叠程度与可达到的分辨率之间存在反比关系。对于2 × 2拼接图，中心高剂量区域（平均剂量308.7 e^?/?²）的分辨率为28.8 ?，而外部区域（平均剂量164.8 e^?/?²）的分辨率为22.4 ?。然而，3 × 3拼接图的内部和外部区域分辨率相同（42.6 ?）。这表明剂量热点可能仅在中等至高分辨率范围内影响可达到的分辨率，而拼接图的整体大小（即平均累积剂量）对高分辨率信息的损失影响更大。较小的拼接图（覆盖约2 μm²）仍可获得令人印象深刻的分辨率。

**精简拼接断层成像促进生物学超微结构探索**

尽管不推荐对大拼接图进行子断层图平均，但研究结果显示，3 × 3拼接图可以覆盖整个酵母细胞，几乎所有核糖体位置、膜性区室和细胞壁都可以被注释。研究人员还尝试在聚焦离子束（focused ion beam, FIB）铣削的上皮细胞薄片上以较低放大倍数（约6.5 ?/像素）采集大型4 × 5拼接图，覆盖面积超过80 μm²，代表单个断层图中几乎完整的薄片。此外，研究人员将拼接断层成像应用于高压冷冻骨骼肌组织，能够显示多个相邻的全长肌节、肌浆网和附近的线粒体，甚至还能观察到中间丝锚定z盘的现象。

**讨论与结论**

MOSAIC代表了目前获得超大视野断层图最直接的方法，其开发精神在于使拼接冷冻电子断层扫描尽可能易于使用。MontageMaker的重要特点是可用于任何成像方案采集的图像。研究人员证明，通过简单降低每张倾斜序列的剂量即可进行超微结构研究，尽管高分辨率结构测定更为困难。这种高分辨率的缺失被对整个细胞和组织分子架构的深入了解所弥补。通过结合低放大倍数成像，研究人员能够获得超过80 μm²的视野，实现对大型细胞景观甚至整个细胞的超微结构分析。MOSAIC方法易于实施，将有助于弥合高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）与体积成像中尺度洞察之间的差距，在阐明控制细胞生物学的分子机制方面发挥关键作用。