气道上皮构成了外部环境与呼吸系统之间的前线界面，并持续暴露于微生物及其组分。流行病学和临床前研究证据日益凸显微生物因素通过维持免疫稳态和调节慢性炎症性疾病恶化在塑造长期呼吸健康中的重要作用。在此，研究人员提出这些持久效应可能源于上皮界面的“印记”事件。新兴证据表明，微生物可通过代谢和表观遗传重编程对气道上皮进行功能性印记，从而塑造后续对微生物和炎症刺激的反应。研究人员提出一个由四个类别组成的上皮印记概念框架：分化改变、耐受、启动和训练免疫。该框架为气道中上皮记忆的机制解析提供了重要基础，并强调了利用微生物因素调节呼吸健康的新的治疗机遇。
**引言**
气道上皮构成外部环境与呼吸系统之间的前线界面。长期以来，上皮被视为一个相对简单的气体交换屏障，但现已日益认识到它是一个由多种功能细胞类型组成的复杂组织，这些细胞能够主动感知微生物和环境线索，展示内在宿主防御机制，协调免疫反应并调控组织修复。气道上皮持续暴露于大量微生物、空气污染物和过敏原。上皮细胞表达多种模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），借此感知并对微生物触发因素作出反应，随后通过释放细胞因子、趋化因子、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和抗菌肽等调节免疫反应。
上呼吸道（upper respiratory tract, URT）定植有细菌、病毒和真菌群落，这些群落共同阻止病原体过度生长和感染肺部。历史上，肺被认为是无菌的。然而，现在已知即使在稳态条件下，肺也存在一个低生物量的微生物群落，该群落具有高度瞬时性。URT是肺部微生物的主要来源，表现为肺中微生物群落丰富度随距离URT距离增加而降低。在疾病状态下，URT微生物组可作为微生物储存库，这些微生物可移位至肺部并发挥致病作用。急性和慢性呼吸道疾病期间呼吸道中存在的微生物组成与稳态期间有显著差异，并可能在疾病进展和恶化中发挥关键作用。
过去几十年，越来越多的研究揭示了微生物通过复杂相互作用介导各种慢性炎症性肺病的免疫病理学或有助于维持免疫稳态。免疫印记的相关性日益清晰，其中环境暴露（如微生物）在靶细胞中诱导持久的代谢和表观遗传改变，即使在初始刺激消退后仍持续存在，从而在健康和疾病中塑造未来宿主反应。微生物和炎症触发因素可通过呼吸道先天免疫细胞中的代谢和表观遗传重连诱导免疫记忆，这既可以保护后续微生物或炎症暴露，也可能加剧呼吸道疾病。
近期研究日益报道，除了免疫细胞，屏障部位的结构细胞（如气道上皮细胞）也可在微生物暴露时被印记。气道上皮的主要作用是提供呼吸道的第一道防线并区分有害和无害暴露，这使其成为微生物印记的主要靶标。然而，潜在的表观遗传和代谢机制才刚刚开始被阐明。本综述将聚焦于微生物和微生物因子如何重编程气道上皮细胞以调节持久免疫效应。因此，本综述旨在提供一个框架，以指导未来关于气道上皮微生物印记的机制和转化研究。
**临床和流行病学相关性**
越来越多的证据显示环境微生物暴露或微生物组组成与长期呼吸结局之间存在相关性，其中上皮是这种交互作用的关键媒介。宿主-微生物相互作用的影响在很大程度上取决于宿主年龄、基因型、微生物或微生物组分的类型以及炎症环境。本节将回顾不同生命阶段微生物-上皮相互作用的关联及其对长期呼吸结局的影响。
**生命早期微生物暴露对呼吸结局的长期影响**
**生命最初几年的呼吸道病毒感染与儿童哮喘**
出生后早期是一个关键窗口期，在此期间环境微生物和肠道微生物组共同塑造生命后期的呼吸道免疫结局，这部分可归因于上皮的印记。病毒或许是描述最充分的能在宿主上留下此类持久印记的微生物。数十年的证据表明，生命最初几年的呼吸道病毒感染，特别是呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）和鼻病毒，结合特应性，会增加儿童哮喘的风险。这种联系是多因素的，可能需要在至少两个风险因素之间发生“两次打击”机制，这些因素可以是遗传性、发育性或环境性的。提出的免疫机制包括病毒和过敏原诱导的炎症通路之间的前馈环路，以及病毒对免疫反应的直接抑制。然而，这些早期感染如何在炎症消退数年后仍产生免疫效应，以及气道上皮如何参与这一过程，仍有待完全阐明。
病毒和细菌感染损害气道上皮完整性，从而促进哮喘发展和恶化。此外，环境诱导哮喘的遗传易感性与编码在气道上皮屏障功能、黏液纤毛清除和上皮稳态中起关键作用的蛋白质的基因遗传变异相关。在生命的第一年，RSV不仅可能破坏屏障功能，还可能诱导气道上皮细胞中与四岁时喘息相关的持久表观遗传改变。这些表观遗传变化随时间维持，在6岁时仍可检测到，进一步强调了这种印记的持久性。婴儿期使用抗F蛋白帕利珠单抗进行RSV免疫预防可调节六岁时鼻上皮细胞的表观遗传重连，支持了持久上皮印记的概念。类似地，生命早期鼻病毒感染可诱导SMAD3启动子中的DNA甲基化变化，该变化至少持续至八岁，并增加患特应性哮喘的风险。
病毒诱导的信号不仅可能直接塑造上皮反应，还可能通过调节URT微生物的定植间接发挥作用，这种定植从生命最早阶段就已开始。出生后最初几天的无症状病毒感染诱导上皮干扰素信号传导，并扰乱URT微生物群的自然成熟，导致致病性莫拉菌属和嗜血杆菌属过度生长。这种特征与整个第一年内急性症状性病毒感染的易感性增加、儿童期持续喘息和哮喘恶化相关。类似地，生命第一年肠道微生物群成熟延迟，例如由于分娩方式、喂养方式、拥挤和抗生素暴露等环境驱动因素，与呼吸道感染易感性增加相关。
有趣的是，URT微生物群较低丰富度（通过咽下抽吸物中细菌扩增子序列变体数量衡量）与气道上皮细胞中改变的DNA甲基化模式相关。这些表观遗传变化导致涉及溶酶体功能和细菌侵袭通路的基因持久调节。这些效应持续到儿童期，并与过敏性鼻炎患病率增加相关。这进一步强调了生命早期微生物暴露与气道上皮长期印记之间的关联，如图1所示。
**环境微生物与肠道微生物组的成熟**
“农场效应”表明，在农场环境中长大的儿童患过敏和哮喘的风险降低。这种现象归因于接触更多样化的环境微生物及其组分，但也例如食用未加工的牛奶、肠道微生物群的成熟或农场粉尘的吸入。小鼠模型显示，慢性吸入低剂量内毒素（LPS）或农场粉尘通过诱导气道上皮细胞中泛素修饰酶A20来预防过敏性哮喘。
婴儿一岁时肠道微生物组的成熟状态与农场暴露和儿童哮喘风险降低相关，这部分由细菌代谢物丁酸介导。这项研究与其他研究一致，表明肠道微生物组成熟延迟，例如由于生命第一年使用两个或更多疗程的抗生素，会增加过敏性疾病发展的风险。最后，最初几个月的纯母乳喂养塑造早期肠道微生物群，并降低呼吸道感染以及RSV和流感感染住院的风险。然而，其对儿童哮喘的影响尚不明确，因为一些研究显示保护作用，而另一些则报告无效应。
**成年期感染与肺部疾病的发展和恶化**
成年期呼吸道感染也可通过调节气道上皮反应来塑造后续呼吸结局，这可能部分通过调节URT微生物群介导。例如，气道中流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和卡他莫拉菌/非液化莫拉菌丰度增加与鼻上皮中ACE2表达增加和COVID-19感染风险增加相关。小鼠研究进一步强调了URT中这种细菌-病毒相互作用的重要性。例如，暴露于表皮葡萄球菌可增加上皮产生的IFN-λ，当小鼠两天后受到攻击时，可抑制后续流感病毒在鼻黏膜中的复制。
呼吸道微生物组也被认为与慢性肺病的发展和进展有关，并有助于确定COPD恶化的风险。例如，流感嗜血杆菌可能通过增加气道上皮细胞上ICAM-1和Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）3的表达，增加COPD患者对RV诱导恶化的易感性。类似地，用铜绿假单胞菌（一种囊性纤维化中众所周知的病原体）反复体外刺激原代支气管上皮细胞，通过减少纤毛细胞标志物表达和增加上皮通透性，降低了病毒感染的阈值。尽管潜在机制仍有待阐明，但肠道微生物组的失调也与COPD等慢性肺病的进展相关。
此外，病毒也可直接调节成人气道上皮的表观遗传过程。鼻病毒感染调节哮喘患者鼻上皮细胞中的DNA甲基化模式，从而改变炎症反应并驱动慢性炎症性肺病的进展和恶化。此外，COVID-19或流感病毒等严重呼吸道病毒感染与人类和小鼠后期患肺癌的风险增加相关。在小鼠中，病毒感染在肺免疫细胞和上皮细胞的细胞因子位点诱导持久的表观遗传改变，持续至少35天，表明上皮印记可能有助于病毒诱导的免疫病理学。
虽然成年期呼吸道感染是慢性肺病恶化的既定触发因素，但其对急性肺损伤的长期影响仍未得到充分研究。尽管大多数肺功能恢复发生在感染后1-2年内，但病毒感染可诱导持久的结构异常，包括间质重塑和瘢痕形成，甚至在病毒清除后15年仍持续存在。这提出了成年期呼吸道感染可能在病毒清除后诱导肺部持久变化从而影响急性肺损伤易感性的可能性，尽管目前缺乏直接支持这一概念的流行病学证据。
**减毒活呼吸道疫苗**
减毒活呼吸道疫苗已被用于理解和增强对微生物挑战的长期免疫。研究最充分的减毒活呼吸道疫苗是减毒活流感疫苗（live-attenuated influenza vaccine, LAIV），其在小鼠模型和学龄儿童中显示出显著效力。此外，减毒活鼻内RSV疫苗正在开发中，并在婴幼儿中显示出有希望的结果。流行病学和机制研究表明，减毒活疫苗甚至可以提供对不相关病原体（包括呼吸道病原体）的保护。例如，卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin, BCG）接种可提供对流感感染的保护，但不能提供对SARS-CoV-2的保护。
迄今为止，研究主要集中于BCG和LAIV对髓系区室的影响。然而，一项研究表明LAIV诱导鼻微生物群组成变化并增加鼻上皮中I型和II型干扰素刺激基因，表明LAIV在气道上皮中留下印记的潜力。上皮作为呼吸道第一道防线的定位，加上上述其他微生物暴露背景下观察到的气道上皮细胞印记，表明减毒活呼吸道疫苗可能诱导气道上皮细胞的持久印记。
**气道上皮细胞的记忆**
**气道上皮**
气道上皮是一个异质性组织，在胎儿发育期间沿近端到远端气道轴模式化为不同的细胞群体。上皮成熟在生命早期持续，出生后最初几年上皮持续分化和结构重塑。气道上皮主要由基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞组成。此外，存在几种罕见上皮群体，包括簇细胞、离子细胞和神经内分泌细胞。基底细胞是再生气道损伤后上皮层并分化为其他上皮谱系的主要祖细胞群体。分泌细胞通过分泌凝胶形成黏蛋白在气道宿主防御中发挥核心作用，这些黏蛋白捕获碎片、污染物和微生物，随后由纤毛细胞通过协调的动纤毛摆动清除。虽然生理性黏蛋白产生起保护作用，但慢性肺病的特征可能是病理性过度黏蛋白产生，促进气道阻塞和炎症。沿近端到远端气道轴，分泌细胞表现出不同的表型，以凝胶形成黏蛋白MUC5AC和MUC5B的差异表达为标志，这些黏蛋白主要由近端气道的杯状细胞产生。相比之下，子宫珠蛋白CC16/SCGB1A1主要由远端气道的棒状细胞表达，而SCGB3A2标记终末和呼吸性细支气管中的分泌细胞。
除了黏液纤毛清除，气道上皮还通过分泌可溶性介质主动调节局部免疫反应。气道上皮细胞产生抗菌肽和分泌型IgA，提供对抗病原体的第一道防线。此外，上皮细胞在其膜上表达PRRs，借此感知病原体并通过分泌细胞因子和趋化因子诱导免疫反应以吸引和激活免疫细胞。这些上皮衍生因子不仅启动炎症反应，还在健康期间维持稳态平衡。
气道上皮是相对稳定的单层，在稳态期间更新有限。虽然尚不清楚气道上皮的确切更新动力学，但小鼠研究表明在稳态下，纤毛上皮细胞在气管中的平均半衰期为六个月，在肺中为十七个月，这转化到人类则为数年。损伤时，气道基底细胞离开静止状态，增殖和分化以恢复上皮层。慢性呼吸疾病中观察到的上皮修复异常可能导致重塑的上皮状态，如鳞状化生和杯状细胞增生。例如，早发性儿童哮喘与hillock-to-squamous上皮重塑相关，涉及抗感染Hillock细胞丧失和以黏膜防御受损和不受控制的炎症为特征的鳞状上皮扩张。在患有慢性呼吸疾病的成人患者中，这些炎症和重塑表型被印记在基底祖细胞中。在特发性肺纤维化中，肺泡区域以重塑的基底样（basaloid）上皮细胞出现为特征，反映肺泡再生过程中的异常过渡细胞状态。这表明在生命早期和慢性炎症性肺病中，持续暴露于疾病相关环境因素可诱导气道和肺泡中上皮细胞状态的持久变化。
**上皮细胞中记忆诱导的要求**
免疫记忆的概念，即细胞可以“记住”感染或其他免疫事件并改变对二次触发因素的反应，在适应性免疫细胞中被广泛接受。近几十年来，先天免疫细胞中印记或记忆形成的新兴概念已被越来越多地探索和接受。除了免疫细胞，肠道和气道中的上皮和其他结构细胞也具有保留先前微生物和炎症暴露印记并启动免疫记忆反应的能力。
这种记忆诱导的基本要求是代谢和表观遗传重连。在初次挑战时，髓系和上皮细胞可经历代谢或表观遗传变化，从而改变其基础激活状态并改变对二次刺激的反应。对于髓系细胞，驱动记忆反应的代谢和表观遗传改变已相当明确。例如，通过Akt/mTOR/HIF1α通路激活有氧糖酵解构成了髓系细胞在代谢水平上记忆诱导的基础。在表观遗传水平，免疫记忆与染色质可及性变化、DNA甲基化修饰和非编码RNA调节相关。染色质可及性变化与免疫基因启动子上的H3K4me3标记，以及增强子区域上的H3K4me1、H3K27Ac和H3K10lac修饰相关。然而，与髓系细胞中的免疫记忆不同，迄今为止尚未发现明确的代谢通路或表观遗传标记作为上皮细胞印记的通用标记。相反，上皮细胞中的改变取决于背景、刺激类型和细胞状态。
这些表观遗传和代谢变化高度关联。代谢中间体作为能量来源和表观遗传重塑的底物，但也作为表观基因组修饰的辅助因子或供体基团，或作为负责表观遗传重塑的酶抑制剂。微生物代谢物可发挥此类功能，如短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFAs）所示，其可阻断组蛋白去乙酰化酶从而影响肺免疫细胞中的表观遗传改变，尽管这种效应尚未在气道上皮细胞中显示。这些代谢和表观遗传改变导致上皮中的记忆形成和未来触发因素下改变的反应。
**印记的类别**
对于髓系细胞，Divangahi等人提出了四种不同的印记模式：（1）分化改变，（2）耐受，（3）启动，和（4）训练免疫。尽管气道微生物上皮印记领域仍处于起步阶段，研究人员认为这种分类为探索气道上皮中的微生物印记事件提供了有用的框架。
在分化改变的情况下，主要刺激改变细胞的增殖和分化行为，从而导致上皮屏障组成不同。这可能影响未来的挑战，因为不同的细胞类型对微生物的反应独特。在耐受的情况下，通常重复或持续的主要刺激在上皮中诱导反应，但未达到全面反应的阈值。这会抑制上皮对后续挑战的反应。在启动的情况下，主要刺激导致上皮的增强或“启动”激活状态。当二次触发到来时，诱导更高的反应。最后，在训练免疫的情况下，主要触发因素在气道上皮中诱导反应，从而在上皮细胞中诱导持久变化。当触发因素移除时，反应恢复到基线。然而，在二次刺激时，上皮产生与第一次刺激相比增强的反应。这四个过程如图2所示。
**微生物与气道上皮的交互作用**
**肠-肺轴**
呼吸道挑战如感染、环境损伤或炎症可改变肠道微生物组的组成。相反，肠道微生物可通过产生影响全身和呼吸道免疫反应的因子影响呼吸道。这种双向交互作用被称为肠-肺轴，近年来已被广泛综述。这些微生物因子包括如代谢物和细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），其可能携带核酸、病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）或其他微生物组分。除了微生物衍生因子，肠道引发的免疫细胞也可从肠道移位到肺部，从而影响肺部炎症，尽管尚不清楚气道上皮是否参与这一过程。在DSS结肠炎小鼠模型中肠道屏障完整性破坏时，甚至整个微生物被证明可从肠道移位到肺部，从而促进肺部炎症。
几种肠道衍生的微生物代谢物已被证明在过敏性气道炎症和呼吸道感染的小鼠模型中影响呼吸道并调节气道上皮细胞功能，从而改变对呼吸道疾病的易感性。例如，L-酪氨酸的微生物代谢被证明通过释放对甲酚硫酸盐缓解尘螨（house dust mite, HDM）诱导的过敏性气道炎症，该代谢物被发现抑制气道上皮细胞的CCL20产生（图3）。此类微生物代谢物的存在可能在生命早期特别重要以维持稳态，因为推测它们在为具有高代谢能力的细胞提供燃料中发挥作用，例如在生命最初两年经历大量分化和形态发生的上皮细胞。此外，吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid, IPA）被证明通过抑制上皮线粒体ROS产生和维持长期线粒体功能来预防年轻小鼠过敏性哮喘的恶化。
在病毒感染背景下，肠道微生物丁酸梭菌产生的18-羟基二十碳五烯酸（18-hydroxy eicosapentaenoic acid, 18-HEPE）在小鼠模型中上调呼吸道上皮中的IFN-λ，增强对流感病毒感染的抵抗力。代谢物乙酸和丁酸也可诱导气道上皮产生IFN，从而诱导针对RSV的抗病毒作用。
**慢性炎症性肺病中的肺微生物组**
在1.2节中，研究人员已描述了呼吸道微生物群与慢性肺病之间的关联。然而，呼吸道微生物组、气道上皮和呼吸疾病结局之间是否存在因果关系仍有待确定。
来自下呼吸道和上呼吸道的呼吸道微生物产生多种信号模式，如结构配体和代谢物，通过这些模式与宿主上皮通信并影响慢性肺病的发展和进展。这些微生物信号包括例如脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、病毒蛋白、微生物RNA、脂肽、肽聚糖、SCFAs和芳香族氨基酸。由此产生的印记反应取决于被刺激的受体，以及局部环境中微生物信号的剂量和组成。微生物还通过分泌微生物挥发性有机化合物（microbial volatile organic compounds, mVOCs）向其他呼吸道微生物和宿主气道细胞发出信号。
微生物还可通过释放可能包含小细菌RNA或其他小化合物的EVs与宿主上皮通信。例如，胞内病原体嗜肺军团菌利用此类含有小细菌RNA的EVs来抑制宿主上皮细胞上的RIG-I和IFN-β表达，以避免被宿主免疫系统清除。它使用的小细菌RNA与miR-144高度相似，miR-144是一种宿主miRNA，通过抑制TRAF6-IRF7信号传导增加小鼠气道上皮细胞中几种病毒的复制。源自稳态呼吸道微生物藤黄微球菌的EVs在体外诱导人气道上皮细胞中miR-4517表达上调。该miRNA抑制单核细胞产生IL-1β，导致ILC3激活减少和哮喘中中性粒细胞炎症减少。这些例子表明EVs是气道上皮细胞免疫通路的有效调节剂。
**上皮微生物印记的机制见解**
**分化改变**
微生物印记上皮的第一种机制是分化改变的概念，即微生物和炎症信号诱导气道上皮重塑，从而对后续损伤产生持久变化。这种现象在病毒感染中描述最为充分，可导致屏障再生能力的长期缺陷。
病毒感染可通过损害基底细胞和肺泡祖细胞的增殖和分化能力来损害上皮的再生能力（图4）。甲型流感感染诱导强烈的IFN-γ信号，通过粘着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）/Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1, YAP）通路驱动发育不良KRT5+基底细胞的形成。在小鼠中，流感感染刺激叶内浆液性（intralobar serous, IS）细胞——一种存在于小鼠肺但不存在于人肺的分泌细胞群体——采用基底细胞命运以重新填充受损上皮。然而，屏障稳态的恢复被阻止，因为这些细胞被编程为在炎症消退后分化回IS细胞。类似地，RSV感染在体外原代人支气管ALI培养中感染后21天减少纤毛细胞数量并增加产生黏液的杯状细胞数量。在COVID-19患者中，黏液纤毛功能受损，上皮再生时黏液产生增加。这种现象可归因于基底上皮细胞的重编程，这些细胞在病毒感染后至少27-51天显示基底细胞和杯状细胞增生。杯状细胞增生可能由原代人气道基底细胞中持续的STAT3过度激活驱动，该激活在体外维持超过四代。啮齿动物模型支持这种病毒诱导的杯状细胞增生并提供进一步的机制见解，表明仙台病毒感染诱导EGFR介导的纤毛细胞长期增生，这些细胞在病毒清除后通过IL-13信号传导转分化为杯状细胞。这种杯状细胞增生也可通过免疫细胞间接诱导，Wfdc21依赖性单核细胞衍生树突状细胞被证明在小鼠仙台病毒感染后诱导气道基底细胞长期重编程，导致感染后至少49天分化为杯状细胞和黏液产生增加。
有趣的是，2型炎症诱导长期基底细胞增生和由于异常分化轨迹导致的低上皮多样性，从而阻止正常上皮恢复并促进疾病。这表明除病毒诱导信号外的炎症触发因素也可通过影响基底细胞分化轨迹影响长期呼吸结局。
气道基底细胞的长期重连在很大程度上通过代谢线索调节。病毒感染诱导基底细胞长期代谢重连，以葡萄糖摄取增加和葡萄糖代谢通路的持续改变为特征，这些改变在病毒清除后1-2年仍可检测到，表明持久的代谢记忆。值得注意的是，这些代谢改变显示出显著的性别依赖性差异，男性来源的上皮细胞中改变更为明显。反过来，此类代谢转变可影响上皮屏障的再生能力，这是一个高度背景依赖的过程。例如，为在卵清蛋白诱导的急性炎症后维持祖细胞的增殖池，需要完整的自噬和功能性葡萄糖代谢。相反，阻断糖酵解增加基底细胞向纤毛细胞和杯状细胞的分化。此外，糖酵解是上皮再生早期阶段基底细胞扩张所必需的，而脂肪酸氧化是随后成功恢复功能完整成熟上皮层所必需的。此外，基底细胞中线粒体丙酮酸代谢的破坏损害再生并在损伤时驱动中间细胞类型积累，这是由控制分化相关基因转录的代谢-表观遗传联系介导的。
除了代谢触发因素，线粒体应激和功能障碍在稳态和细菌感染期间的气道上皮分化中起决定性作用。例如，肺炎链球菌的致病性感染在体外和体内诱导支气管上皮细胞线粒体功能障碍，导致NAD+产生减少和细菌复制增加。在出生后肺泡发育期间，线粒体复合体I缺乏NAD+生成激活肺泡上皮中的整合应激反应基因，驱动肺泡中功能失调过渡细胞积累并阻碍正确分化。
**耐受**
在耐受的情况下，重复低剂量暴露于微生物触发因素导致上皮反应保持在触发炎症阈值以下，导致低反应状态和后续刺激反应降低。这一现象在肠道中已被广泛展示，其中慢性低剂量暴露于共生微生物及其组分诱导肠上皮耐受。类似地，URT中在稳态期间存在的微生物可能诱导气道上皮的耐受。鉴于URT中高细菌生物量和肺中低细菌生物量，可以假设鼻上皮的耐受阈值可能高于肺上皮，尽管这需要研究。
气道上皮耐受可改变后续疾病结局的一个例子是“农场效应”，即慢性吸入农场粉尘中的LPS可在儿童后期预防过敏性疾病和哮喘。有趣的是，非农场家庭中的LPS暴露也与哮喘发展风险降低相关。此外，宿主脂肪酶诱导的共生肠道细菌系统性LPS失活使呼吸道上皮细胞对HDM诱导的过敏性哮喘敏感。相反，抑制脂肪酶恢复LPS水平并预防哮喘。这提供了进一步证据，表明不仅环境LPS，体内系统性LPS也可使呼吸道上皮细胞脱敏以预防过敏性哮喘的发展。
这种慢性低剂量LPS诱导气道上皮耐受并保护小鼠免受HDM诱导的哮喘发展。机制涉及在呼吸道上皮中诱导负性NF-κB调节因子，即泛素修饰酶A20。该酶通过去泛素化TLRs下游必需信号分子抑制NF-κB激活。编码A20的基因中的单核苷酸多态性增加了在农场长大的儿童患哮喘和过敏的风险。这种A20介导的耐受诱导也在肠道中观察到，其中LPS暴露诱导肠上皮细胞中A20介导的耐受表型，使新生儿肠上皮对LPS脱敏。其他微生物衍生产物也可诱导气道上皮细胞耐受，尽管效应取决于给药剂量、微生物因子、宿主背景、环境因素和疾病阶段。
气道上皮的耐受诱导至少部分受表观遗传调控，如研究表明A20的诱导通过组蛋白修饰和DNA甲基化介导。小鼠气道上皮细胞接受TLR配体刺激后组蛋白去乙酰化酶的激活参与耐受诱导，表现为洗脱后TLR配体再刺激时细胞因子产生减少，尽管未研究该效应的持久性。类似地，鼻内给予鼠李糖乳杆菌GG衍生的DNA通过启动子去甲基化导致气道上皮PD-L1上调，从而通过促进Th2细胞凋亡抑制过敏。
微生物代谢物也可能参与调节气道上皮耐受。最近一项研究表明，小鼠3周龄时早期抗生素给药导致气道上皮长期改变，并加剧成年期过敏性气道炎症，这可通过口服IPA挽救。值得注意的是，即使在六周同笼饲养（导致肠道微生物组和全身代谢组完全正常化）后，这种易感性仍得以维持。虽然该表型归因于上皮的持久线粒体功能障碍，这与过敏性哮喘易感性增加相关，但推测平行表观遗传机制也可能参与这种上皮耐受调节。
肺炎链球菌等病原体也可能通过表观遗传重连使气道上皮细胞对二次感染更易感，这种重连在细菌清除后至少持续9天。有趣的是，这些对上皮的长期影响可能是供体依赖性的，如离体实验所示，其中预先暴露于鞭毛蛋白可在鞭毛蛋白洗脱后四天根据供体减少或加剧对第二次微生物挑战的反应。哪些病原体利用这一机制以及是否可归类为耐受或应归类为印记反应的另一个亚类是一个灰色地带。
**启动**
微生物衍生的亚炎症（即强直性）水平IFNs和PAMPs可启动气道上皮，导致对二次触发因素的增强反应。这种启动屏障状态对宿主可能是有益的，因为病原体可更有效地清除，但当过度炎症驱动疾病时也可能有害。结果在很大程度上取决于背景（例如病原体或微生物刺激物的种类和剂量）。
肠道微生物组已被证明在细菌和病毒感染背景下通过多种途径启动气道上皮。例如，将富含产肠毒素脆弱拟杆菌（enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF）的哮喘肠道微生物组接种到人源化无菌小鼠中，在过敏性气道炎症期间诱导肺上皮氧化应激，从而加剧炎症。微生物代谢物，如肠道衍生的乳酸，可能通过上调线粒体电子转运基因调节肺上皮中的这种氧化应激和线粒体呼吸。增加的系统性循环乳酸浓度可能启动肺部损伤，这与急性肺损伤患者中乳酸水平升高与疾病严重程度增加相关一致。除影响线粒体活性的微生物代谢物外，肠道衍生的琥珀酸被证明增加小鼠肺组织和人支气管上皮细胞系中的蛋白质琥珀酰化，特别是SOD2蛋白（一种清除ROS并保护免受氧化应激的关键抗氧化酶）的琥珀酰化，从而降低其酶活性并加剧本小鼠过敏性气道炎症。这些论文因此表明微生物对呼吸道上皮的启动增加氧化应激并恶化炎症性肺病中的疾病结局。然而，气道上皮线粒体ROS产生增加也可有利于对抗细菌性肺部感染。
在病毒感染背景下，气道上皮也可被肠道衍生的微生物代谢物启动。啮齿动物模型表明，丁酸梭菌诱导代谢物18-HEPE分泌，通过上调肺上皮细胞中IFN-λ表达增强对流感病毒感染的抵抗力。同样，肠道微生物衍生的乙酸被证明通过诱导肺上皮中的干扰素反应保护小鼠免受RSV感染。直接在小鼠气道中给予微生物衍生的乙酸也通过增强IFN-β和IFN-λ表达增加对RSV的抗病毒免疫反应。这些发现得到体外模型支持，表明用IFN-γ和IL-13启动人支气管细胞系通过表观遗传改变增强对RSV的抗病毒反应。有趣的是，鼻病毒呼吸道感染可通过增强人原代气道上皮细胞中的抗病毒干扰素反应来启动气道上皮，从而在3天后预防SARS-CoV-2或甲型流感病毒的二次感染。
**训练免疫**
“训练免疫”可由β-葡聚糖等微生物配体或BCG、含麻疹疫苗或AS01佐剂疫苗等疫苗诱导，在髓系细胞中引起代谢和表观遗传变化，已被广泛综述。越来越多的证据表明不仅先天免疫细胞，结构细胞（包括肠道和口腔上皮细胞）也可经历“训练”过程。在小鼠模型中，IL-25训练的肠道簇细胞在四周后对肠道病毒71型（enterovirus 71, EV71）感染产生增强反应。在口腔黏膜中，代谢-表观遗传轴在白色念珠菌暴露后诱导口腔上皮长期记忆，从而提供对后续真菌感染的保护。
近期研究表明呼吸道上皮细胞可类似地发展训练免疫样表型。例如，早期URT微生物群的组成与6岁时上皮细胞中改变的DNA甲基化谱和儿童期过敏性鼻炎发展增加相关，这可能表明一种训练免疫形式。训练免疫也已在体外显示，通过将人支气管基底细胞预先暴露于重复鼻病毒感染或鞭毛蛋白。鞭毛蛋白预暴露导致表观遗传变化和IL-6和IL-8产生增加，即使在初始刺激四天前洗脱后，对致病性真菌烟曲霉分生孢子的二次挑战也是如此。类似地，β-葡聚糖预处理在五天静息期后增加肺上皮细胞系A549对金黄色葡萄球菌的反应，这依赖于ROS产生和表观遗传改变。
除了表观遗传重连，代谢重编程是训练免疫的另一个关键标志。这种重编程的中心机制是有氧糖酵解的激活，通过Akt/mTOR/HIF1α信号通路介导。确实，用鞭毛蛋白刺激人支气管上皮细胞诱导训练免疫表型，其特征为mTOR调控的代谢重连和对糖酵解依赖性增加。单细胞转录组学表明这种代谢mTOR调控的重编程可能是细胞类型特异性的，炎症分泌细胞显示最强的mTOR调控重编程，而炎症基底细胞显示增强的氧化磷酸化特征。
**讨论**
呼吸道上皮持续暴露于源自肠道和呼吸道微生物组的微生物衍生因子。这些因子可诱导气道上皮细胞中的代谢和表观遗传变化，留下改变其对后续挑战反应的持久印记，并影响疾病易感性和进展。本综述讨论了微生物印记的机制，使用从髓系细胞生物学改编的框架，作为未来开发有效策略以通过利用这种微生物-上皮相互作用预防或治疗呼吸疾病的设定点。
正如预期，这种上皮印记过程的区分并非总是黑白分明，一些机制可能无法被提出的框架充分捕获。研究人员仅使用分化改变、耐受、启动和训练免疫的类别来对当前文献中报道的微生物对气道上皮产生长期效应的研究进行分类。研究人员确定了严格分类印记机制的一些局限性。例如，如上所述，上皮细胞预暴露于鞭毛蛋白以高度供体依赖的方式减少或加剧对二次微生物挑战的反应，说明上皮印记并不总是符合明确的类别。近期证据支持这一观点，并表明气道上皮中主要微生物印记的结果可能高度背景依赖，并在很大程度上由二次刺激的性质驱动。鼻内接种TLR4和TLR7/8配体在小鼠中诱导针对多种细菌和病毒感染的持久广谱保护，但也针对HDM等过敏原。在这种情况下，增强的抗微生物反应类似于训练免疫，而过敏性哮喘的抑制类似于耐受机制。这种保护与肺驻留免疫细胞和上皮细胞中持续至少3个月的持久表观遗传改变相关。尽管机制证据主要将肺泡巨噬细胞作为这种效应的因果介质，但它表明微生物印记的效应可能取决于二次挑战的性质。
类似地，肺炎链球菌感染通过诱导上皮中持久表观遗传重连使气道上皮细胞对二次感染更易感。病原体用于逃避二次免疫反应的此类表观遗传修饰是否应被解释为耐受诱导，或是否应更好地描述为四种提议类别未涵盖的独特印记机制，仍未解决。
越来越多的证据表明呼吸道上皮与免疫细胞类似可被微生物触发因素印记。然而，鉴于稳态下上皮更新率低，这些印记机制的持久性尚不清楚，以及持久性是否取决于受影响的上皮细胞类型（例如祖细胞或分化细胞）仍不清楚。在溃疡性结肠炎患者中，炎症记忆在肠道干细胞中在无免疫刺激的类器官培养中长期传代过程中得以维持，强调了肠道上皮中炎症记忆的持久性。有迹象表明慢性肺病如COPD和囊性纤维化中存在长寿命上皮祖细胞特征，但微生物印记是否能在气道上皮中留下类似持久印记仍有待研究。
上皮中印记效应的持久性代表一个关键考虑因素，应在临床前研究中引起更多关注。目前的体外和小鼠研究大多在相对较短的时间框架内研究效应，通常限于数天，最多延长至数周。此外，要将效应定义为印记，需要证据表明初始微生物刺激及其直接下游效应在二次挑战前已消退，这在当前文献中未被系统证明。因此，证明持续表观遗传或代谢重编程对于加强印记上皮状态的证据很重要。
解读气道上皮微生物印记研究时第二个重要考虑因素是所采用的实验模型。目前的体外研究使用了永生化气道上皮细胞系和原代气道上皮细胞，两者各有优缺点。虽然永生化细胞系对于剖析上皮印记的机制有价值，但它们不能完全重现体内气道上皮的分化状态、细胞多样性、代谢过程和表观遗传景观。由于微生物印记涉及持久表观遗传和代谢重编程，基线细胞状态可能影响印记反应。永生化诱导的染色质组织和代谢改变因此可能影响上皮对微生物刺激反应中记忆的建立和持久性。原代气道上皮细胞此外更接近地反映体内气道上皮的细胞多样性和分化状态，特别是在ALI分化时。原代培养也可能更好地保留可能塑造印记反应的供体特异性特征。此外，供体间变异常见，可能本身反映先前环境暴露、疾病相关重塑或表观遗传印记的差异。虽然这种变异性可能使数据解释复杂化，但也可能提供对上皮记忆反应个体间差异的见解。因此，在永生化细胞系中获得的结果应谨慎解读，并尽可能在原代细胞模型中验证，理想情况下使用多个供体以捕获供体变异性。
印记效应的持久性甚至可能超越个体，在植物和秀丽隐杆线虫中显示了跨代效应。哺乳动物中跨代气道上皮印记效应已被证明通过妊娠期间微生物代谢物从母亲到胎儿的胎盘转移介导。给怀孕小鼠喂食高纤维饮食或乙酸补充剂被证明通过胎儿肺和后代Tregs中的表观遗传改变抑制后代的过敏性气道疾病。此外，最近一项研究表明母体蠕虫感染重连母体肠道微生物组，导致IPA转移至后代，通过诱导肺中上皮IFN-I反应保护后代免受RSV和甲型流感病毒感染。这些研究强调了母体微生物组可能已在印记胎儿气道上皮以确保生命早期呼吸免疫稳态中发挥作用。
在人类中，有一些跨代印记的证据，尽管潜在机制仍有待阐明。例如，母体和父体BCG接种（以BCG瘢痕存在为标志）与后代早期死亡率降低相关。此外，父亲吸烟对后代未来肺功能产生负面影响，尽管不确定上皮印记是否起作用。因此，微生物印记效应是否可在人类中跨代遗传仍然是一个重要的研究课题，因为这可能揭示产前甚至孕前干预的机会窗口。
另一个开放问题是印记的时间。印记刺激在生命早期给予与生命后期给予是否有差异？以及是否存在（老年）年龄效应？肺在出生后继续发育，生命最初几年持续上皮分化和出生后肺泡化。在此时间窗口内，正常肺发育依赖于受控表观遗传调控，而早期
