DHODH是PIK3CA突变结直肠癌的合成致死靶点

《Cell Reports》：DHODH is a synthetic lethal target in PIK3CA-mutant colorectal cancer

　　

癌细胞获得由致癌突变驱动的独特代谢和信号传导依赖性。定义这些突变特异性依赖性可以揭示治疗机会。在此，研究人员将二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）确定为PIK3CA突变结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中的选择性代谢依赖性。DHODH通过促进尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）的生成来维持WDR77的O-GlcNAc糖基化（O-GlcNAcylation）和蛋白质稳定性，从而维持PI3K-AKT信号传导。DHODH的遗传或药理学抑制可降低WDR77蛋白丰度、减少磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT），并损害癌细胞自我更新和肿瘤起始。尿苷补充可恢复WDR77和AKT信号传导，而O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）耗竭则消除这种恢复，从而建立了一个将嘧啶代谢与信号传导维持联系起来的UDP依赖性机制。用DHODH抑制剂HL6治疗可重现遗传表型，并抑制异种移植、原位和患者来源的CRC模型中的肿瘤生长。该研究表明，蛋白质稳定性的代谢调节是CRC中致癌基因特异性依赖性的关键机制。

**论文解读：DHODH作为PIK3CA突变结直肠癌的合成致死靶点研究**

**一、研究背景与问题**

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球常见的恶性肿瘤之一，其发生发展涉及多种基因突变。PIK3CA（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α）基因突变是CRC中最常见的致癌事件之一，约见于15%–20%的病例。此类突变组成性激活PI3K-AKT信号通路，驱动异常细胞增殖、侵袭、转移及干样肿瘤细胞特性的维持。尽管PI3K抑制剂已被评估为靶向治疗药物，但其在CRC中的临床效用受到疗效有限和剂量限制性毒性的制约。因此，亟需开发利用PIK3CA突变CRC独特脆弱性的替代治疗策略。合成致死（synthetic lethality）描述了一种同时破坏两个基因导致细胞活力丧失，而单独抑制任一基因均可耐受的条件。大规模遗传筛选技术的进步使得系统识别不同癌症基因型中的此类情境特异性遗传依赖性成为可能。在CRC中，PIK3CA突变约见于五分之一的肿瘤，并改变支持生长和存活的信号传导及代谢途径。例如，PIK3CA突变通过上调GPT2增强谷氨酰胺代谢，并增加对三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环酶OGDH的依赖性。这些观察揭示了一个代谢合成致死的图景，其中致癌突变重塑代谢网络以产生情境特异性脆弱性。

**二、研究内容与结论**

研究人员通过分析DepMap数据库，利用全基因组CRISPR-Cas9筛选数据，识别出DHODH（二氢乳清酸脱氢酶）作为PIK3CA突变而非野生型CRC细胞系中的合成致死脆弱性。TCGA（癌症基因组图谱）亚组分析显示，DHODH高表达与携带PIK3CA突变的患者较差的生存期相关。机制上，DHODH促进UDP-GlcNAc的合成，驱动WDR77的O-GlcNAc糖基化介导的稳定性，从而维持AKT通路活性。使用高效小分子HL6对DHODH进行药理学抑制可重现这些分子效应，损害癌症干性，并在异种移植、原位和患者来源的CRC模型中显著抑制肿瘤生长。该研究发表在《Cell Reports》上，确立了DHODH作为PIK3CA突变特异性依赖性，并建立DHODH抑制作为PIK3CA突变CRC的一种有前景的治疗策略。

**三、关键技术方法**

研究人员主要运用了以下关键技术方法：（1）基于DepMap数据库的全基因组CRISPR-Cas9筛选，识别PIK3CA突变CRC的选择性依赖性基因；（2）RNA测序（RNA-seq）及基因集富集分析（GSEA），解析DHODH敲低或抑制后的转录组变化及信号通路富集情况；（3）免疫沉淀（IP）、质谱分析（LC-MS/MS）及O-GlcNAc糖基化位点鉴定，阐明DHODH通过UDP-GlcNAc调控WDR77 O-GlcNAc糖基化及稳定性的分子机制；（4）酶活性测定、等温滴定量热法（ITC）、细胞热位移分析（CETSA）及共晶结构解析，表征DHODH抑制剂HL6的亲和力及结合模式；（5）多种体内模型评估药效，包括异种移植瘤模型、原位结直肠癌模型及患者来源异种移植瘤（PDX）模型。样本来源包括DepMap数据库、TCGA数据库以及上海交通大学医学院附属瑞金医院提供的结直肠癌患者肿瘤标本。

**四、研究结果**

**（一）DHODH是PIK3CA突变CRC细胞的选择性依赖性**

研究人员利用DepMap数据库的全基因组CRISPR-Cas9筛选数据，比较PIK3CA突变型与野生型CRC细胞系的基因依赖性评分，识别出19个候选基因，其中DHODH为PIK3CA突变CRC细胞所选择性需求。TCGA队列亚组分析显示，在PIK3CA突变患者中，DHODH高表达与较差的总体生存期显著相关，而PIK3CA野生型患者中无此关联。在体外集落形成实验中，DHODH敲低显著抑制了PIK3CA突变细胞（RKO、LS180、HCT116、DLD1）的集落形成能力，而对野生型细胞（HCT8、HT29、SW480、SW620、LOVO）影响较小。异种移植瘤实验证实，DHODH敲低显著抑制RKO细胞（PIK3CA突变）来源的肿瘤生长，而对SW480细胞（野生型）来源的肿瘤无显著影响。

**（二）DHODH维持PIK3CA突变CRC的癌症干性和AKT信号传导**

DHODH敲低严重损害RKO和LS180细胞的肿瘤球形成能力和自我更新能力，体内有限稀释实验显示肿瘤起始细胞频率显著降低。RNA-seq和GSEA分析显示，DHODH敲低后，胚胎干细胞相关基因特征和PI3K-AKT信号通路显著负富集。免疫印迹分析证实，DHODH敲低降低p-AKT（Ser473）及其下游效应分子p-S6K和p-GSK3的水平。CCLE反相蛋白阵列（RPPA）数据分析显示，PIK3CA突变CRC细胞系中p-AKT水平升高。免疫组化染色进一步证实，PIK3CA突变CRC患者肿瘤组织中p-AKT水平显著升高。

**（三）DHODH通过维持WDR77稳定性以促进PRMT5介导的AKT激活**

PRMT5及其结合伴侣WDR77形成的甲基转移酶复合物催化AKT的精氨酸对称二甲基化（symmetric dimethylation of arginine，SDMA），该修饰是AKT随后磷酸化和激活的先决条件。DHODH敲低显著降低AKT的SDMA修饰水平。进一步研究发现，DHODH敲低显著降低WDR77蛋白水平，而PRMT5水平不变。WDR77敲低可降低AKT磷酸化及SDMA修饰，并损害肿瘤球形成能力。WDR77过表达可恢复DHODH敲低细胞中p-AKT水平和球形成能力。机制研究表明，WDR77主要通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解，DHODH敲低增加了WDR77的泛素化水平。

**（四）DHODH依赖性UDP产生通过O-GlcNAc糖基化支持WDR77稳定性**

DHODH是嘧啶从头合成的限速酶。DHODH敲低导致UDP和UDP-GlcNAc水平降低。外源性尿苷补充可恢复DHODH敲低细胞中WDR77蛋白水平和p-AKT水平。免疫共沉淀和质谱分析鉴定WDR77为OGT相互作用蛋白，并确定丝氨酸250（S250）为WDR77的O-GlcNAc糖基化位点。S250A突变显著降低WDR77的O-GlcNAc糖基化水平并缩短其半衰期。DHODH或OGT敲低均降低WDR77的O-GlcNAc糖基化水平和蛋白丰度。OGT敲低损害肿瘤球形成能力并降低p-AKT水平，WDR77过表达或蛋白酶体抑制可恢复该表型。

**（五）HL6是强效DHODH抑制剂，可重现DHODH敲低效应**

研究人员开发了新型DHODH抑制剂HL6，其半数抑制浓度（IC₅₀）为5.29 nM，较FDA批准的DHODH抑制剂来氟米特的活性代谢物A771726（IC₅₀ = 420 nM）强约50倍。等温滴定量热法（ITC）显示HL6与DHODH结合的解离常数（K_d）为56.7 nM。共晶结构解析（PDB ID：9V34）显示，HL6的苯并噻唑核心深嵌于DHODH的辅酶Q（coenzyme Q，CoQ）结合口袋，通过氢键和疏水相互作用实现高亲和力结合。HL6处理降低了WDR77蛋白水平和p-AKT水平，缩短WDR77半衰期，降低其O-GlcNAc糖基化水平。HL6处理显著抑制PIK3CA突变CRC细胞的自我更新能力和细胞活力，而对野生型细胞影响较小。

**（六）HL6在原位和PDX模型中抑制PIK3CA突变CRC肿瘤生长**

在RKO皮下异种移植瘤模型中，口服HL6（10 mg·kg^-1·day^-1）显著抑制肿瘤生长，且耐受性良好。在RKO-Luc原位结直肠癌模型中，HL6治疗实现了86.7%的肿瘤消退率，显著高于来氟米特阳性对照的43.0%。在患者来源异种移植瘤（PDX）模型中，HL6对PIK3CA突变PDX（PDX-02）的肿瘤抑制率达81.75%，显著高于PIK3CA野生型PDX（PDX-01）的37.09%，证实了基因型选择性治疗效应。

**五、讨论与结论**

该研究将DHODH确定为PIK3CA突变CRC的合成致死靶点，并阐明了一条将嘧啶生物合成与AKT通路维持联系起来的代谢-信号传导轴。DHODH通过UDP-GlcNAc驱动的O-GlcNAc糖基化机制维持WDR77稳定性，从而保持AKT激活和癌症干性。DHODH的遗传或药理学抑制可去稳定WDR77，抑制下游PI3K-AKT信号传导，并在异种移植、原位和PDX模型中损害肿瘤生长。该研究揭示了蛋白质稳定性的直接代谢控制，建立了DHODH-WDR77-AKT轴，对PIK3CA突变CRC的肿瘤维持至关重要。研究结论指出，通过整合基因组学、生物化学和结构分析，确立了PIK3CA突变与DHODH依赖性之间的合成致死关系，并引入HL6作为有效利用该脆弱性的高亲和力抑制剂。这些发现揭示了核苷酸代谢与致癌信号传导之间的机制联系，为精准癌症治疗中靶向代谢控制的信号维持提供了概念框架。