H3K18乳酸化驱动肝细胞癌中CD8+ T细胞排斥和抗PD-1耐药

《Cell Reports》：H3K18 lactylation drives CD8+ T cell exclusion and anti-PD-1 resistance in hepatocellular carcinoma

　　

糖酵解代谢促进肝细胞癌（HCC）中的免疫抑制微环境，但其在免疫治疗耐药中的作用尚不清楚。在PET/CT上表现出高¹⁸F-FDG摄取量的HCC患者显示出降低的抗PD-1反应。高糖酵解驱动的H3K18la水平与免疫治疗耐药、CD8⁺ T细胞浸润受限及不良预后相关。抑制H3K18la可抑制HCC进展并增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫。机制上，H3K18la增加TRPS1和ETV1启动子处的染色质可及性，上调其转录。TRPS1增强糖酵解和GLUT1介导的CD8⁺ T细胞旁观者杀伤抵抗，而ETV1驱动的CCL2创造免疫抑制微环境，限制CD8⁺ T细胞积累。GLUT1抑制剂BAY-876、抗CCL2抗体和抗PD-1抗体的三联组合可增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫。H3K18la-TRPS1/ETV1-GLUT1/CCL2轴可作为免疫治疗耐药的生物标志物，破坏该轴可使HCC对免疫治疗敏感。

**论文解读**

**研究背景**
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，具有高度致死性。近年来，免疫治疗取得显著进展，靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点阻断（ICB）已成为晚期HCC的一线系统治疗。然而，仅15%-25%的患者对ICB治疗有反应，低免疫应答率严重限制了其临床应用。因此，阐明肿瘤对免疫治疗的耐药机制，以开发更有效的治疗策略，是当前亟需解决的问题。

肿瘤细胞代谢适应有氧糖酵解（Warburg效应）是其标志性特征之一。HCC细胞摄取更多葡萄糖以增加ATP水平，从而支持增强的糖酵解并促进其恶性进展和免疫逃逸。近期研究发现，组蛋白乳酸化是一种由乳酸介导的代谢源性表观遗传修饰，在癌症进展中发挥关键作用。例如，组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化（H3K18la）被发现通过激活YTHDF2表达促进眼黑色素瘤的发生。在结直肠癌中，突变KRAS诱导的H3第9位赖氨酸乳酸化（H3K9la）与癌症进展相关。值得注意的是，已有报道组蛋白乳酸化与HCC中的免疫抑制肿瘤微环境（TME）密切相关，凸显其作为免疫治疗靶点的潜力。尽管如此，组蛋白乳酸化如何使HCC细胞实现免疫逃逸并因此损害免疫治疗反应，仍知之甚少。此外，通过靶向组蛋白乳酸化来提高免疫治疗效果的干预策略仍有待进一步探索。

**研究内容与结论**
在本研究中，研究人员发现H3K18la是驱动HCC抗PD-1免疫治疗耐药的关键潜在靶点。机制上，由有氧糖酵解引起的H3K18la水平升高，增加了HCC细胞中转录抑制因子GATA结合1（TRPS1）和E-二十六转化特异性变体1（ETV1）启动子区域的染色质可及性，从而诱导其转录。H3K18la-TRPS1-GLUT1糖酵解正反馈环路强化了HCC细胞对CD8⁺ T细胞旁观者杀伤的抵抗。此外，ETV1通过促进趋化因子（C-C基序）配体2（CCL2）转录来抑制CD8⁺ T细胞浸润。最终，研究人员发现，由GLUT1抑制剂BAY-876、抗CCL2中和抗体和抗PD-1抗体组成的三联组合疗法，通过靶向代谢-免疫信号轴，增强了CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫，并显著改善了HCC患者的ICB反应。该研究发表在《Cell Reports》上。

**关键技术与方法**
研究人员采用回顾性队列研究，纳入四川大学华西医院80例接受抗PD-1免疫治疗的HCC患者（29例应答者，51例无应答者），通过分析治疗前¹⁸F-FDG PET/CT结果评估肿瘤糖酵解水平。利用免疫组化（IHC）检测多种组蛋白乳酸化修饰水平，筛选出H3K18la。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）和RNA测序（RNA-seq）联合分析，鉴定H3K18la的下游靶基因。采用Seahorse XF糖酵解压力分析测量细胞外酸化率（ECAR）。通过Transwell共培养系统区分直接杀伤和旁观者杀伤。构建裸鼠皮下异种移植模型、肺转移模型和肝原位植入模型进行体内实验。使用C57BL/6小鼠建立免疫健全模型，评估三联疗法（BAY-876、抗CCL2抗体、抗PD-1抗体）的疗效。

**研究结果**
**1. 升高的H3K18la水平与HCC患者免疫治疗耐药和不良预后相关**
通过分析华西医院HCC患者治疗前PET/CT结果，发现无应答者（NR）的最大标准化摄取值（SUVmax）显著高于应答者（R）。肿瘤组织乳酸含量在无应答者中更高。IHC筛选显示，H3K18la在无应答者中升高最显著，且与CD8⁺ T细胞浸润呈负相关。高H3K18la表达与微血管侵犯（MVI）、多发肿瘤、晚期、高甲胎蛋白（AFP）水平及低分化显著相关，且与更短的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关。体外实验表明，乳酸处理增加H3K18la水平并促进HCC细胞增殖、迁移、侵袭，同时增强对CD8⁺ T细胞杀伤的抵抗；沉默LDHA则抑制H3K18la并增强杀伤效果。

**2. H3K18la在HCC细胞中激活TRPS1和ETV1的转录**
ChIP-seq显示乳酸处理后H3K18la峰在启动子区域富集，KEGG分析富集于转录失调、MAPK、代谢和PD-L1/PD-1信号通路。ATAC-seq和RNA-seq联合分析发现33个基因在转录活性、染色质可及性和H3K18la富集上同步增加，其中TRPS1和ETV1上调超过2倍。Western blot证实氧化酸（oxamate）降低H3K18la的同时TRPS1和ETV1蛋白水平平行下降，乳酸则相反。ChIP-qPCR验证H3K18la富集于TRPS1和ETV1启动子。引入H3K18R突变（阻断乳酸化）显著减弱TRPS1和ETV1的转录上调，并降低染色质可及性和活性组蛋白标记的富集。TCGA数据显示TRPS1和ETV1在多数癌症中高表达，且与晚期和较差生存相关。

**3. H3K18la调控的TRPS1通过上调GLUT1驱动HCC恶性进展、有氧糖酵解和CD8⁺ T细胞旁观者杀伤抵抗**
IHC显示TRPS1在无应答者中高表达，且与较差生存相关。TRPS1敲低抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，过表达则相反。体内裸鼠实验证实TRPS1促进肿瘤生长和转移。Transwell共培养实验表明，TRPS1敲低增加CD8⁺ T细胞旁观者杀伤（而非直接杀伤），且逆转了乳酸诱导的杀伤抵抗。体内免疫健全小鼠模型显示TRPS1不影响CD8⁺ T细胞浸润，但影响其功能。RNA-seq和GSEA分析揭示TRPS1调控葡萄糖转运和代谢相关通路，并鉴定GLUT1为直接靶基因。双荧光素酶报告和ChIP实验证实TRPS1直接结合GLUT1启动子。TRPS1敲低降低葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP含量和ECAR，过表达则相反。H3K18la-TRPS1-GLUT1形成正反馈环路，促进糖酵解和旁观者杀伤抵抗。

**4. ETV1通过促进CCL2转录抑制CD8⁺ T细胞浸润**
ETV1在无应答者中高表达，但不影响CD8⁺ T细胞直接杀伤能力。体内小鼠模型显示，ETV1敲低减少肿瘤体积和重量并增加CD8⁺ T细胞浸润，过表达则相反。CIBERSORT分析证实ETV1与CD8⁺ T细胞浸润负相关。机制上，ETV1转录上调CCL2，双荧光素酶和ChIP实验验证ETV1直接结合CCL2启动子。敲低ETV1可逆转H3K18la驱动的CCL2上调。体内实验表明，敲低CCL2可逆转ETV1过表达引起的CD8⁺ T细胞浸润抑制。

**5. GLUT1/CCL2联合抑制延缓肿瘤生长并增强抗PD-1免疫治疗**
体外实验显示，BAY-876（GLUT1抑制剂）联合氧化酸有效逆转H3K18la介导的糖酵解增强，并增强CD8⁺ T细胞杀伤能力，增加TNF-α和IFN-γ产生。裸鼠模型证实BAY-876联合氧化酸显著抑制TRPS1过表达肿瘤的生长，并降低H3K18la、TRPS1、GLUT1和Ki-67表达。在C57BL/6小鼠肝原位模型中，BAY-876单独抑制肿瘤生长并增加IFN-γ⁺和TNF-α⁺ CD8⁺ T细胞比例；加入抗CCL2进一步抑制肿瘤并增加CD8⁺ T细胞浸润；BAY-876、抗CCL2和抗PD-1三联组合达到最显著的肿瘤消退和CD8⁺ T细胞活化。系统毒性评估未发现明显异常，表明该方案具有良好安全性。

**6. H3K18la-TRPS1/ETV1-GLUT1/CCL2-CD8轴预测HCC免疫治疗反应**
IHC分析HCC免疫治疗后样本，显示无应答者中H3K18la、TRPS1、ETV1、GLUT1和CCL2表达升高，CD8⁺ T细胞浸润减少。相关性分析验证了各分子间的正相关及与CD8⁺ T细胞的负相关。低H3K18la/TRPS1/ETV1/高CD8表达组合的患者对免疫治疗反应更好，生存更优。多个独立ICB临床试验队列（GSE78220、GSE91061、IMvigor210等）验证了该轴的预测价值。

**讨论与结论**
本研究表明，HCC免疫治疗耐药患者表现出升高的有氧糖酵解和乳酸积累，导致H3K18la增加，进而转录激活TRPS1和ETV1。TRPS1通过上调GLUT1加速癌症进展并赋予CD8⁺ T细胞旁观者杀伤抵抗，而ETV1通过转录上调CCL2抑制CD8⁺ T细胞浸润，共同形成免疫抑制TME。三联组合疗法同时靶向GLUT1、CCL2和PD-1，是克服免疫治疗耐药、改善HCC患者临床结局的有前景策略。研究结论：H3K18la-TRPS1/ETV1-GLUT1/CCL2信号轴可作为免疫治疗耐药的生物标志物，破坏该轴可使HCC对免疫治疗敏感。