整合单细胞eQTL与GWAS分析揭示食管鳞状细胞癌易感性的细胞类型特异性调控机制

《Cell Reports》：Integrative single-cell eQTL and GWAS analyses identify cell-type-specific regulatory mechanisms underlying ESCC susceptibility

　　

在食管鳞状细胞癌（ESCC）这一具有显著遗传成分的恶性肿瘤中，在相关细胞背景下解读遗传风险变异仍是一个核心挑战。研究人员将单细胞RNA测序与基因型数据整合，构建了涵盖ESCC组织中上皮、免疫和基质区室的细胞类型分辨表达数量性状基因座（sc-eQTL）图谱。大多数调控效应具有高度细胞类型特异性，且在批量转录组分析中基本无法检测。与ESCC全基因组关联研究（GWAS）的整合揭示了风险变异在特定细胞群体中的显著富集，其中以上皮侵袭细胞最为突出。细胞类型特异性转录组全关联分析（TWAS）、孟德尔随机化（SMR）和共定位分析优先确定了RPS3A为易感基因，其遗传调控表达与ESCC风险变异共定位，并在恶性进展过程中表达升高。精细定位确定了影响RPS3A表达的协同增强子-启动子变异，整合功能分析提示RPS3A参与选择性剪接程序。这些结果建立了用于解读ESCC遗传易感性的细胞类型分辨调控框架。

**论文解读：整合单细胞eQTL与GWAS分析揭示食管鳞状细胞癌易感性的细胞类型特异性调控机制**

**一、研究背景与科学问题**

食管鳞状细胞癌（ESCC）是中国食管癌的主要组织学亚型，约占病例总数的90%，且与癌症相关死亡率密切相关。大规模全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出多个ESCC易感位点，包括ALDH2、ADH1B、CHEK2、RUNX1、CYP26B1和HEATR3，凸显了遗传变异在疾病风险中的重要作用。然而，对于大多数位点而言，其潜在的致病基因和调控机制仍未被完全阐明，这导致关联信号与生物学解释之间存在显著差距。

值得注意的是，大多数ESCC风险变异位于非编码区，并富集于推定调控元件中，提示遗传易感性主要通过调控基因表达程序而非蛋白序列改变来介导。表达数量性状基因座（eQTL）作图将遗传变异与基因表达调控联系起来，为研究复杂疾病的遗传基础提供了有力框架。然而，现有的大多数eQTL资源来源于批量转录组数据，其表达测量代表异质细胞群体的平均值。ESCC发生于复杂的肿瘤生态系统中，包含上皮、免疫和基质等多个区室，这些区室表现出不同的转录程序。在这一背景下，批量eQTL分析可能掩盖仅限于特定细胞亚群或在不同细胞类型间存在差异的调控效应。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够实现细胞异质性和细胞类型特异性基因表达的高分辨率分析。将scRNA-seq与基因型数据整合可实现单细胞eQTL（sc-eQTL）作图，从而在特定细胞背景和不同谱系中解析调控效应。尽管在胃、结直肠、肺、血液和脑组织中的研究表明sc-eQTL方法能够揭示批量分析中无法检测的广泛细胞类型特异性调控变异，但食管组织（尤其是与ESCC相关的细胞生态系统）的系统性细胞类型分辨eQTL图谱尚未建立。

**二、研究内容与主要结论**

该研究发表于《Cell Reports》，研究人员将scRNA-seq与基因型数据整合，生成了ESCC组织的细胞类型分辨eQTL图谱。通过纳入ESCC GWAS汇总统计，应用细胞类型特异性转录组全关联分析（TWAS）、基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）和共定位分析来优先确定候选易感基因并界定其可能的细胞作用背景。这一整合框架为解读ESCC遗传风险提供了精细策略，将遗传变异与特定细胞群体中的情境依赖性基因调控联系起来。

研究在25种细胞群体中鉴定出56,609个显著的sc-eQTL关联，对应32,114个调控变异（eSNP）和2,866个eGene。研究发现55.2%的sc-eQTL仅在单一细胞类型中检测到，表明ESCC的遗传调控高度依赖细胞背景。与ESCC GWAS的整合分析显示，风险变异在特定细胞群体中显著富集，其中侵袭性上皮细胞最为突出。细胞类型特异性TWAS、SMR和共定位分析将RPS3A确定为高置信度易感基因，其遗传调控表达与ESCC风险变异共定位，并在恶性进展过程中表达升高。精细定位鉴定出rs2280283和rs77852985两个功能性调控变异，通过增强子-启动子协同作用共同调控RPS3A表达。功能实验表明，RPS3A敲低诱导广泛转录重编程，并通过调控UBE2W外显子3跳跃和SLC16A1-AS1可变末端外显子选择参与选择性剪接程序调控。

**三、主要技术方法**

该研究主要采用以下关键技术方法：（1）整合46例ESCC患者的scRNA-seq与基因型数据进行sc-eQTL作图，涵盖25种上皮、免疫和基质细胞群体；（2）利用94例ESCC样本的批量RNA-seq数据进行批量eQTL分析以评估异质性；（3）整合两个GWAS数据集（共3,929例病例和4,144例对照）进行风险变异富集分析；（4）应用S-PrediXcan进行细胞类型特异性TWAS分析；（5）应用SMR和HEIDI检验区分多效性与连锁；（6）应用coloc进行共定位分析；（7）对3例新收集的ESCC肿瘤样本进行scATAC-seq分析，并整合4例公开scATAC-seq数据集；（8）在KYSE150和KYSE30细胞系中进行双荧光素酶报告基因实验验证调控变异功能；（9）结合RNA-seq、Oxford Nanopore长读长测序和eCLIP-seq鉴定RPS3A调控的选择性剪接靶基因。

**四、研究结果**

**（一）ESCC的细胞类型分辨顺式调控图谱**

通过对46例ESCC患者的单细胞转录组与基因型数据进行整合分析，研究在25种细胞群体中共鉴定出56,609个显著的sc-eQTL关联（FDR < 0.1），对应32,114个eSNP和2,866个eGene。sc-eQTL显著富集于转录起始位点（TSS）附近、基因近端调控区及活性染色质状态区域，同时富集于DNase I超敏位点和活性组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3）标记区域，并富含多种癌症相关转录因子（包括MYC、RELA、STAT5A、FOXM1和YY1）的结合位点。

**（二）ESCC的遗传调控受细胞背景强烈塑造**

分析显示，55.2%的sc-eQTL仅在单一细胞类型中检测到，细胞类型特异性程度在19.9%（CD4_Th1细胞）至89.8%（增殖细胞）之间变化。大多数细胞类型特异性eGene在多种细胞类型中广泛表达，但仅在特定细胞类型中表现出遗传调控，提示情境依赖性调控程序是细胞类型特异性遗传效应的主要驱动因素。例如，PCK2在全部25种细胞群体中广泛表达，但仅在增殖细胞中与rs422068显著关联。CD55在CD4_Treg和Macro_IL1B细胞中受rs2564978调控的方向相反。共享eQTL的效应量大于细胞类型特异性eQTL（p < 2.20 × 10^-16），其相关eGene富集于细胞黏附、免疫调节和细胞衰老等核心生物学通路。在94例ESCC样本的批量eQTL分析中，仅不到17%的sc-eQTL在可比显著性阈值下被重复。

**（三）细胞类型特异性染色质可及性构成sc-eQTL活性的基础**

通过对3例新收集的ESCC肿瘤样本进行scATAC-seq分析并整合4例公开数据集，研究在23种匹配的细胞类型中鉴定出平均60,825个可及染色质峰。sc-eQTL变异与最近可及染色质区域的距离显著小于匹配对照SNP。不同细胞类型显示出不同的转录因子（TF）基序景观，上皮群体富集TP53和TP63基序，T细胞亚群富集ATF3和EOMES基序。eSNP与可及染色质的重叠表现出强烈的细胞类型特异性，并与eQTL活性模式密切对应。例如，与ENTPD1 eQTL相关的eSNP rs4075311仅在CD4_Treg细胞中与开放染色质重叠，而与ERAP2 eQTL相关的eSNP rs2548537在多种细胞类型中与可及染色质重叠。

**（四）细胞类型分辨遗传整合优先确定ESCC易感基因**

在两个独立GWAS数据集中，sc-eQTL变异对于ESCC相关变异表现出显著且一致的富集，其中侵袭细胞富集最强（p = 3.25 × 10^-42）。TWAS分析鉴定出191个遗传预测表达水平与ESCC风险相关的eGene（p_TWAS < 0.05），SMR分析将其精炼至68个具有一致遗传关联的eGene（p_SMR < 0.05且p_HEIDI > 0.01）。共定位分析显示RPS3A与ESCC风险变异存在共定位证据（PP.H4 > 0.50），将其确定为高置信度易感基因。

**（五）协同增强子-启动子变异调控ESCC中RPS3A表达**

RPS3A表达在高级别上皮内瘤变和ESCC的上皮细胞中相较于正常食管上皮显著升高。在与rs72963695处于强连锁不平衡（r² > 0.8）的77个候选变异中，rs2280283和rs77852985位于活性组蛋白修饰标记区域，并与侵袭细胞中的开放染色质重叠。HiChIP数据显示包含rs77852985的推定增强子区域与RPS3A启动子之间存在长距离染色质相互作用。双荧光素酶报告基因实验显示，rs2280283-C等位基因比rs2280283-T等位基因具有更高的启动子活性，rs77852985-C等位基因比rs77852985-T等位基因具有更强的增强子活性。四种单倍型组合显示rs2280283-C/rs77852985-C单倍型具有最高调控活性，rs2280283-T/rs77852985-T活性最低，表明两个变异协同调控RPS3A转录。

**（六）RPS3A调控ESCC细胞中的选择性剪接**

RNA-seq分析显示RPS3A敲低后共鉴定出5,948个差异表达基因，富集于p53信号、细胞周期调控、上皮-间质转化（EMT）和PI3K-Akt信号等癌症相关通路。Oxford Nanopore长读长测序鉴定出691个差异选择性剪接（AS）事件（p < 0.05，|ΔPSI| > 0.2），以外显子跳跃为主要类别，相关基因富集于RNA剪接、泛素依赖性蛋白分解代谢和代谢等通路。eCLIP-seq与RNA-seq及ONT剪接分析的整合鉴定出13个高置信度候选靶基因。其中，RPS3A结合UBE2W前体mRNA外显子3，敲低RPS3A促进外显子3跳跃，产生含提前终止密码子（PTC）的短异构体，可能触发无义介导的mRNA降解（NMD）。对于长链非编码RNA SLC16A1-AS1，RPS3A敲低促使剪接转向长异构体，该异构体含有更多推测的miRNA结合位点，可能具有更强的竞争性内源RNA海绵活性。

**五、讨论与结论**

该研究构建了ESCC组织的细胞类型分辨顺式eQTL图谱，并整合遗传关联数据以研究遗传变异如何在特定细胞背景下影响基因调控。研究揭示，ESCC中相当大比例的调控效应高度依赖细胞类型，且在批量转录组分析中基本被掩盖。这一发现与来自其他组织和疾病的研究证据一致，强调了细胞身份和状态对癌症相关变异功能后果的约束作用。细胞类型分辨eQTL作图不仅提高了检测能力，还通过将变异与其可能的效应细胞群体联系起来，实现了对遗传风险更精确的解读。

研究将sc-eQTL作图与TWAS和SMR分析整合，优先确定了一组候选易感基因及其可能的细胞作用背景。RPS3A作为示例展示了如何通过多层次分析将非编码GWAS信号追溯至合理的调控机制。RPS3A编码40S核糖体亚基的组成部分，除经典核糖体功能外，还参与凋亡和细胞分化等过程。功能实验提示RPS3A可能参与转录后调控，包括控制UBE2W和SLC16A1-AS1等靶转录本的选择性剪接。RPS3A介导的剪接调控可能影响不同下游通路：UBE2W外显子3跳跃引入PTC并可能通过NMD降低功能性转录本丰度，从而扰乱蛋白质稳态相关过程；SLC16A1-AS1可变末端外显子选择可能改变其作为竞争性内源RNA的能力，从而调节miRNA可用性。

该研究存在以下局限性：稀有细胞群体的统计效能受细胞数和供体覆盖度限制；TWAS和SMR分析采用名义显著性阈值而非正式多重检验校正；功能分析主要集中于一个代表性位点和一个下游靶基因；实验在细胞系模型中提供机制支持，仍需在原发性组织和体内系统中进一步验证。总之，该研究通过群体规模基因分型与单细胞转录组学的结合，提供了补充ESCC现有批量资源的细胞类型分辨调控参考，建立了从统计遗传信号到复杂癌症基因组机制假设的可行分析框架，并强调了转录后调控作为遗传变异影响肿瘤易感性的另一层次。