《Cell Reports》：Distinct endogenous retroviruses are expressed in mutational subtypes of clear cell renal cell carcinoma and are linked to improved clinical outcomes
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染色质调控因子的不同突变和转座元件（TEs）的异常表达，已在特定透明细胞肾细胞癌（ccRCC）临床情境中与免疫治疗（IO）的临床获益相关联。然而，染色质调控因子突变与TE表达之间的关系，以及它们对临床结局的影响，尚不完全清楚。在此，研究人员识别了在ccRCC不
染色质调控因子的不同突变和转座元件（TEs）的异常表达，已在特定透明细胞肾细胞癌（ccRCC）临床情境中与免疫治疗（IO）的临床获益相关联。然而，染色质调控因子突变与TE表达之间的关系，以及它们对临床结局的影响，尚不完全清楚。在此，研究人员识别了在ccRCC不同突变亚型中表达的TEs，其中内源性逆转录病毒（ERVs）构成了所观察到TEs的大多数。在这些ERVs中，ERV 544和ERV 2014在PBRM1突变样本中上调。高表达这些ERVs并伴有体细胞PBRM1突变的患者，在接受IO单药治疗（而非靶向治疗）时，无进展生存期得以改善，并且它们的上调与先天免疫通路的表达相关。在PBRM1缺陷的ccRCC细胞中，ERV 544和ERV 2014位点的染色质可及性增加，并且在ccRCC细胞系克隆中，体外PBRM1敲除后ERV 544和ERV 2014上调。总体而言，该研究支持了PBRM1突变、随后的染色质可及性变化以及ccRCC中异常但具有免疫反应性的ERVs之间的联系。
**研究背景与问题**
透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是肾癌最常见的亚型，约占全球癌症诊断的2%。尽管ccRCC的肿瘤突变负荷较低，但它被认为是一种免疫原性癌症。ccRCC的特征性改变包括染色体3p的体细胞缺失和VHL肿瘤抑制基因失活，以及染色质调控因子（如PBRM1、SETD2、BAP1、KDM5C）和PI3K-MTOR通路成员的突变。目前晚期ccRCC的治疗主要包括免疫检查点阻断疗法、免疫治疗（immunotherapy, IO）与抗血管生成靶向药物的联合方案，以及HIF2α抑制。以往研究已表明，特定的基因组改变（如PBRM1突变）与特定临床情境下对IO或抗血管生成治疗的良好反应相关。此外，ccRCC中还存在内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses, ERVs）的异常表达，这是一种转座元件（transposable element, TE）。部分ERVs（如HERV-E或hERV4700）的表达与ccRCC患者的临床获益相关。然而，不同ccRCC突变亚型中TE（尤其是ERV）表达的整体图谱及其与临床结局的潜在关联尚不完全清楚。此外，ccRCC中ERV表达的细胞类型特异性模式及这些位点的潜在表观遗传调控机制也未知。
**研究目标与结论**
研究人员旨在表征ccRCC突变亚型特异性的TE表达模式，并探讨其与临床结局的关联。通过整合接受IO治疗和未治疗的ccRCC患者肿瘤RNA测序（RNA-seq）数据以及ccRCC细胞系数据，研究人员发现全局TE表达在不同临床队列和细胞系中一致，但特定ERVs在ccRCC突变亚型中差异表达。其中，ERV 544和ERV 2014在PBRM1突变样本中上调，而在BAP1突变样本中下调。在IO治疗队列中，高表达这两种ERV并伴有PBRM1体细胞突变的患者，在接受IO单药治疗（而非靶向治疗）时，无进展生存期（progression-free survival, PFS）显著改善，且这种上调与先天免疫通路的激活相关。利用单细胞ATAC测序（scATAC-seq）数据，研究人员发现PBRM1缺陷的ccRCC细胞中ERV 544和2014位点的染色质可及性增加。体外实验证实，在ccRCC细胞系克隆中敲除PBRM1足以诱导这两种ERV的上调。该研究揭示了PBRM1突变、随后染色质可及性变化以及异常但具有免疫反应性的ERVs之间的机制联系，为ccRCC中突变亚型特异性ERV表达模式及其与临床结局的关联提供了支持。该论文发表在《Cell Reports》。
**主要关键技术与方法**
1. 利用TEtranscripts和hervQuant等计算工具，对多个ccRCC RNA-seq数据集（包括IO治疗队列CheckMate 009/010/025及Miao et al.队列、未治疗TCGA-KIRC队列、CCLE细胞系及A704细胞系）进行TE和ERV表达定量及差异表达分析。
2. 采用单细胞ATAC测序（scATAC-seq）技术，对来自ccRCC CPTAC队列（n=23例患者样本）的肿瘤细胞进行染色质可及性分析，并使用scTE方法评估TE可及性。
3. 通过CRISPR-Cas9介导的核糖核蛋白（RNP）电穿孔法，在786O ccRCC细胞系中建立PBRM1敲除单细胞克隆，并利用RT-qPCR验证ERV表达变化。
**研究结果**
**全局TE在ccRCC临床队列和细胞系中的表达**
在IO治疗ccRCC（n=107）、TCGA-KIRC（n=301）和CCLE ccRCC（n=8）三个队列中，长末端重复序列（LTR）、长散在核元件（LINEs）、短散在核元件（SINEs）和DNA转座子这四类TE的平均相对表达模式相似，且不随病理分期、肿瘤分级或IO临床获益而显著改变。
**TE在ccRCC突变亚型中的表达**
尽管平均TE表达在PBRM1、SETD2、KDM5C和BAP1突变亚型间无显著差异，但特定TE亚家族在突变型与野生型之间存在差异表达。在PBRM1突变样本中，差异表达的TEs中LTR类占多数（76%），其中ERV1家族成员最为突出。在SETD2、KDM5C和BAP1亚型中同样识别出差异表达TEs。
**突变亚型中差异表达的ERV**
利用互补计算策略，研究人员在PBRM1突变样本中识别出多个差异表达ERVs，包括先前报道的ERV 2256（HERV-E）和ERV 4700。在SETD2、KDM5C和BAP1突变亚型中也识别出相应的差异表达ERVs。共有52个（占3,173个参考ERVs的1.6%）ERVs在多个突变亚型中重复差异表达。
**突变亚型特异性ERV表达与生存的关联**
在IO治疗队列中，多个ERVs的表达（作为连续变量）与总体生存期（OS）或无进展生存期（PFS）名义相关。其中，ERV 544和ERV 2014（均为HERV-H家族）在PBRM1突变样本中上调，在BAP1突变样本中下调，且该模式在CM025和IMMotion150两个外部验证队列中得到确认。在IO队列中，高表达ERV 544或2014且伴有PBRM1突变的患者，其PFS显著优于其他样本亚组（log rank检验p=0.039和0.025），而在靶向治疗（依维莫司）队列中无此关联。此外，ERV高表达样本中富集了Toll样受体（TLR）、RIG-I、JAK/STAT和IRF等先天免疫通路，而非适应性免疫通路。
**ERV染色质可及性与表达评估**
利用scATAC-seq数据，研究人员发现，在推定恶性细胞中，携带PBRM1功能缺失突变的患者样本中ERV 544和2014位点的染色质可及性高于野生型PBRM1患者。CD45+免疫细胞中ERV 2014的可及性较低，表明其具有肿瘤特异性。通过scTE分析，多个TE在肿瘤细胞或免疫细胞中表现出细胞类型特异性活性模式。
**PBRM1缺失的体外验证**
在786O ccRCC细胞系中通过CRISPR-Cas9敲除PBRM1后，RT-qPCR检测显示，在四个单细胞克隆中的三个克隆中，ERV 544和ERV 2014的表达上调，与之前报道的ERV 4700模式相似，但ERV 2256和ERV 2637未呈现一致上调。
**讨论与结论**
该研究系统地揭示了ccRCC中突变亚型特异性的TE表达模式，尤其是LTR类/ERVs。PBRM1突变导致特定ERV位点（如ERV 544和2014）染色质可及性增加，进而引起其异常表达。这种异常表达与先天免疫通路的激活相关，并与PBRM1突变协同，选择性地与IO治疗后的PFS改善相关联。研究结论为：PBRM1突变、随后的染色质可及性变化以及异常但具免疫反应性的ERVs之间存在机制联系，这些发现可能为ccRCC的免疫治疗生物标志物开发提供新思路。研究局限性包括：TE表达可能受读段多映射的混淆；部分ERV读段可能来自非恶性细胞；不同队列的临床特征差异可能影响结果的普适性；需要进一步实验验证ERV衍生的抗原呈递等。
