整合性3D基因组和表观基因组分析鉴定TP53RK和SYBU为HCC中干性和抗肿瘤免疫的关键调控因子

《Cell Reports》：Integrative 3D genome and epigenomic analysis identifies TP53RK and SYBU as critical regulators of stemness and anti-tumor immunity in HCC

　　

三维（3D）基因组组织在调控基因表达和肿瘤细胞特性中发挥基础作用。然而，高阶染色质结构如何调控肝细胞癌（HCC）的干性仍不清楚。在此，研究人员描绘了低分化和高分化HCC细胞的3D染色质景观，并发现了与干性相关的A/B区室化、拓扑关联结构域（TAD）边界和增强子-启动子环的重塑。这些结构改变导致TP53RK和SYBU的差异表达，它们对HCC干性和进展发挥相反作用。TP53RK通过增强线粒体自噬（mitophagy）促进肿瘤干性，而SYBU通过抑制MAPK信号（MAPK signaling）抑制干性。值得注意的是，TP53RK表达与PD-1正相关，联合抑制TP53RK和PD-1显著增强抗肿瘤免疫。研究人员的发现将3D基因组架构确定为肿瘤干性的关键决定因素，并强调TP53RK是HCC中一个有前景的治疗靶点。

肝细胞癌（HCC）是全球主要的癌症死亡原因之一，其高复发率和转移性主要归因于肿瘤内异质性和癌症干细胞（CSCs）驱动的治疗抵抗。尽管三维（3D）基因组组织在基因调控和肿瘤细胞特性中起核心作用，但高阶染色质结构如何调控HCC干性仍不清楚。为揭示这一机制，研究人员以低干性（Hep3B）和高干性（SNU449）HCC细胞系为模型，整合Hi-C、ATAC-seq、CUT&Tag和RNA-seq等多组学数据，系统性描绘了不同干性状态下的3D染色质景观，并鉴定了由染色质重构驱动的关键干性调控因子TP53RK和SYBU。该研究证实，TP53RK通过增强线粒体自噬（mitophagy）维持干性，而SYBU通过抑制MAPK信号（MAPK signaling）抑制干性，且TP53RK与PD-1表达正相关，联合抑制TP53RK和PD-1可显著增强抗肿瘤免疫。论文发表在《Cell Reports》。

**主要关键技术方法**：研究人员利用Hi-C技术分析全基因组A/B区室、拓扑关联结构域（TAD）和染色质环；采用ATAC-seq评估染色质可及性；通过CUT&Tag检测组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me3、H3K27me3）；结合RNA-seq进行转录组分析。样本来源包括公共数据库（GEO: GSE226216、GSE226215）中的Hep3B和SNU449细胞Hi-C和ATAC-seq数据，以及自主产生的CUT&Tag和RNA-seq数据。此外，还使用了TCGA-LIHC队列、15对HCC患者组织、患者来源类器官（PDOs）及多种小鼠模型（异种移植、极限稀释、尾静脉注射等）。

**研究结果**：

**1. 3D染色质架构与不同干性HCC细胞的转录景观**：通过比较Hep3B（低干性）和SNU449（高干性）细胞，研究人员发现高干性细胞中广泛存在A/B区室重组（B-to-A和A-to-B转换占40.3%），TAD尺寸显著减小，且染色质可及性和组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me3增加，H3K27me3减少）发生协同变化，并伴随MAPK信号通路（如ERK1/2级联）的激活。在Hep3B来源的成球细胞（高干性）中同样观察到类似染色质重构，证实干性本身驱动了3D基因组变化。

**2. 整合多组学分析鉴定TP53RK为HCC干性驱动因子**：通过整合ATAC-seq、CUT&Tag和RNA-seq数据，研究人员筛选出48个在SNU449中表观遗传协同激活的调控区域，并锁定9个位于B-to-A区室转换区的基因，其中TP53RK对干性标记物（EpCAM、CD90、CD44）的影响最强。TP53RK位点展现增强的染色质可及性、活性组蛋白修饰富集、抑制性修饰减少，以及一个连接启动子与远端增强子的长程染色质环，该环在成球细胞中增强。TCGA-LIHC分析显示TP53RK在HCC肿瘤中高表达，与不良预后正相关，并与干性标记物表达正相关。

**3. TP53RK通过维持干性加速HCC进展**：敲低TP53RK抑制SNU449细胞增殖、克隆形成、迁移、成球能力，并降低干性标记物表达；敲低也抑制患者来源类器官（PDOs）的形成。在体内，TP53RK敲低显著减小异种移植瘤体积和重量，极限稀释分析显示肿瘤起始细胞（CSC）频率降低。通过CRISPR-Cas9删除TP53RK位点的增强子-启动子环锚（ΔTP53RK-LA）可降低TP53RK表达并抑制干性。在尾部静脉注射（HTVI）小鼠模型中，肝细胞特异性抑制Tp53rk同样减少肿瘤负荷。相反，过表达TP53RK增强Hep3B细胞的干性特征。

**4. AP-1转录因子偶联染色质重塑与HCC干性**：通过基序富集和足迹分析，研究人员发现AP-1家族成员（FOSL2、JUNB、FOS）在高干性细胞中活性增强。敲低FOS、FOSL2或JUNB均降低SNU449细胞的成球能力和干性标记物表达，并下调TP53RK表达，提示AP-1转录因子通过调控TP53RK表达参与干性维持。

**5. 多组学整合揭示SYBU为HCC干性抑制因子**：通过反向策略，研究人员鉴定出27个在SNU449中表观遗传协同沉默的调控区域，其中8个位于A-to-B区室转换区，SYBU对干性标记物的抑制作用最强。SYBU位点呈现染色质可及性降低、活性组蛋白修饰丢失、抑制性修饰增加，以及长程增强子-启动子环减弱。TCGA-LIHC及多个独立队列显示SYBU在肿瘤中低表达，低表达与不良预后相关，且与干性标记物负相关。成球细胞中SYBU蛋白水平降低。

**6. SYBU作为HCC干性和致瘤性抑制因子**：过表达SYBU抑制SNU449细胞增殖、迁移、成球能力，降低干性标记物表达，并抑制PDOs形成。在体内，过表达SYBU减小异种移植瘤体积和重量，降低CSC频率。敲低SYBU在Hep3B细胞中增强干性特征，增加肿瘤起始能力。删除SYBU位点的增强子环锚（ΔSYBU-LA）可抑制SYBU表达并上调干性标记物。在HTVI小鼠模型中，肝细胞特异性激活Sybu显著减少肿瘤负荷。

**7. TP53RK通过线粒体自噬驱动干性，而SYBU抑制MAPK信号**：TP53RK敲低后的RNA-seq揭示线粒体自噬通路受抑制，关键基因（ULK1、ATG9A等）下调。TP53RK与ULK1相互作用并促进ULK1 Ser555磷酸化，增强线粒体自噬；高干性（CD44^high）细胞中线粒体自噬活性更高。TP53RK过表达促进成球，而TP53RK抑制剂（pomalidomide、fusidic acid）或线粒体自噬抑制剂（Mdivi-1）可逆转此效应。相反，SYBU过表达后的RNA-seq显示MAPK信号通路相关基因下调，Western blot证实MEK和ERK磷酸化降低，TCGA数据中SYBU与MAPK通路节点基因负相关。

**8. 靶向TP53RK增强免疫检查点阻断疗效**：TCGA-LIHC分析显示高TP53RK表达与调节性T细胞（Tregs）浸润增加、CD8⁺ T细胞耗竭增强及PD-1表达正相关，该关联在多种癌症中普遍存在。在Hepa1-6同基因小鼠模型中，TP53RK抑制剂pomalidomide（Pom）与抗PD-1抗体联合治疗显著抑制肿瘤生长，优于单药治疗，且未引起明显毒性。联合治疗显著增加肿瘤内CD8⁺ T细胞比例，并增强其产生IFN-γ、TNF-α和GZMB的功能。

**总结讨论部分**：研究人员在讨论中指出，该研究首次将HCC干性与3D染色质架构重塑直接联系起来，通过整合多组学分析揭示了TP53RK和SYBU作为关键效应分子，其表达受增强子-启动子长程环和表观遗传修饰的精确调控；TP53RK通过ULK1依赖的线粒体自噬维持干性，而SYBU通过抑制MAPK信号拮抗干性；TP53RK还通过塑造免疫抑制性肿瘤微环境影响免疫治疗反应，其抑制与PD-1阻断协同增强抗肿瘤免疫。同时，研究人员承认研究的局限性：Hep3B与SNU449的遗传背景差异可能混淆干性相关染色质差异，但后续成球实验部分排除了此干扰；仍需原发性肿瘤细胞验证TP53RK和SYBU的功能；TP53RK调控免疫微环境的分子机制有待深入探究。

**研究结论翻译**：总之，研究人员的发现表明，HCC干性受大规模3D染色质架构重编程的调控，并鉴定出TP53RK和SYBU为关键效应因子，其表达受到染色质可及性及长程增强子-启动子相互作用的协同变化的精确控制。干扰这些调控轴会显著改变癌症干性、肿瘤生长和免疫微环境。值得注意的是，抑制TP53RK与PD-1阻断协同作用，揭示了一种潜在联合治疗策略。这些结果共同揭示了肝癌干性背后的染色质驱动机制，并强调了基于表观基因组的干预是增强免疫治疗疗效的有前景的手段。