《Cell Reports》：Architecture of distal tips of motile cilia is shaped by the pseudoenzyme Jhc1 in non-mammalian vertebrates
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运动纤毛是进化上保守的细胞器，在发育和组织稳态中发挥重要作用。与核心支架不同，远端区域的研究相对较少，并展现出跨物种的显著多样性。本研究描述了一种此前未被表征的纤毛蛋白Jhc1（just the head of cilia 1，Loc108698169），该蛋
运动纤毛是进化上保守的细胞器，在发育和组织稳态中发挥重要作用。与核心支架不同，远端区域的研究相对较少，并展现出跨物种的显著多样性。本研究描述了一种此前未被表征的纤毛蛋白Jhc1（just the head of cilia 1，Loc108698169），该蛋白定位于多纤毛细胞（multiciliated cell，MCC）纤毛的极远端末端，且仅由非哺乳类脊椎动物基因组编码。Jhc1对爪蟾（Xenopus）纤毛的正常结构和功能至关重要，且该功能在爬行类和鱼类的Jhc1中保守。系统发育分析和结构建模提示，Jhc1起源于硫胺素三磷酸酶（thiamine triphosphatase，Thtpa）的基因复制和新功能化，该酶的关键催化残基已丢失，并被对纤毛定位至关重要的残基所取代。这些数据为理解脊椎动物进化过程中运动纤毛末端结构广泛多样化的分子机制提供了见解。
**论文解读：伪酶Jhc1塑造非哺乳类脊椎动物运动纤毛远端末端结构**
**一、研究背景与科学问题**
运动纤毛（motile cilia）是一类进化上高度保守的细胞器，广泛存在于从单细胞藻类到人类的各类细胞中。在哺乳动物中，9+2型运动纤毛在中枢神经系统脑脊液流动、呼吸道黏液清除以及生殖道配子运输等生理过程中发挥不可或缺的作用。在非哺乳类脊椎动物中，运动纤毛承担着更为多样的功能，例如鱼类和两栖类前肾中的体液稳态维持、两栖类幼虫皮肤中纤毛介导的液体流动以促进气体交换和清除微生物，以及鱼类鼻腔中纤毛促进嗅觉动态液体交换等。此外，运动纤毛还在多种非哺乳类脊椎动物中演化出新颖且尚未被充分探索的功能，如蛇毒腺、成年鲟鱼胃部及雀鳝鱼鳔等组织中的纤毛。
尽管运动纤毛的核心结构——基于微管的轴丝（axoneme）和基体（basal body）——自真核生物最后共同祖先以来变化甚微，负责构建和维持纤毛的分子机器（如鞭毛内运输系统、动力蛋白马达和放射辐）也高度保守，但运动纤毛的远端末端却展现出跨物种、跨细胞类型乃至跨发育阶段的显著多样性。例如，衣藻和四膜虫等单细胞生物中，中央微管对延伸超出微管双联体并插入附着于纤毛膜末端的帽状结构；哺乳动物气管和输卵管上皮中，无定形末端帽覆盖中央微管对及A管单微管，并通过纤毛膜发出的纤维连接至纤毛冠；成年蛙腭部纤毛末端呈现两个不对称板状结构；而蝌蚪表皮运动纤毛末端则为球状结构。研究人员近期发现Ccdc78和Ccdc33定位于爪蟾、小鼠和人类多纤毛细胞（multiciliated cell，MCC）9+2运动纤毛的极远端末端（extreme distal tip，EDT），但介导该区域物种特异性特化的分子机制几乎完全未知。
基因复制和新功能化是进化新颖性产生的重要机制之一，已有证据表明纤毛其他区域存在此类现象——多个关键纤毛蛋白为非催化性伪酶（pseudoenzyme），如Ulk4（Unc-51-like kinase 4）在进化过程中逐渐丢失关键催化残基但仍对运动纤毛生成至关重要，伪磷酸酶Styxl1在精子轴丝组装中发挥支架蛋白作用，NME家族多个成员在进化中丧失催化活性并在纤毛中承担结构功能。基于上述背景，本研究旨在鉴定并表征一种此前未知的、可能参与塑造非哺乳类脊椎动物运动纤毛远端末端结构的蛋白。
**二、研究内容与主要发现**
研究人员鉴定了一个此前未被表征的蛋白，命名为Jhc1（just the head of cilia 1，Loc108698169），该蛋白定位于爪蟾运动纤毛的极远端末端。值得注意的是，Jhc1不存在于哺乳动物中，但在蛙类、鱼类和爬行类中均为纤毛结构和功能所必需。序列比较和结构建模揭示，Jhc1与硫胺素三磷酸酶（thiamine triphosphatase，Thtpa）具有相似的架构，但Thtpa的关键催化残基在Jhc1中缺失，且其中至少一个残基对Jhc1的纤毛定位至关重要。研究数据表明，Jhc1起源于Thtpa的古老复制事件及其后的功能分化，代表了一种谱系特异性的分子机制，塑造了非哺乳类脊椎动物运动纤毛的远端结构。该研究发表于《Cell Reports》。
**三、主要技术方法**
本研究采用了以下关键技术方法：利用亲和纯化结合质谱（affinity purification-mass spectrometry）鉴定与Ccdc33相互作用的蛋白；使用吗啉代寡核苷酸（morpholino-oligonucleotide）进行靶基因敲低（knockdown，KD）实验；采用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼中建立F0代基因敲除系（crispants）；运用AlphaFold3进行蛋白质三级结构预测和蛋白-蛋白相互作用建模；开展系统发育分析（包括PSI-BLAST、HHPred、FoldSeek、MAFFT多序列比对和IQ-TREE最大似然法建树）；利用全胚原位杂交（whole mount in situ hybridization，WISH）检测基因表达；分析单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据和ChIP-seq数据。实验样本包括非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎和斑马鱼（Danio rerio）胚胎。
**四、研究结果**
**（一）Jhc1定位于爪蟾MCC运动纤毛的极远端末端**
通过亲和纯化和质谱分析，研究人员发现Ccdc33与未表征蛋白Loc108698169存在相互作用。在爪蟾MCC中表达Halo标记的Loc108698169后，发现其与GFP-Ccdc33共定位于EDT区域，位于Spef1标记的中夹对延伸（central pair extension）远端。与其它EDT蛋白一致，Halo-Loc108698169在发育中/延伸中的纤毛和全长稳态纤毛中均表现出稳定的EDT定位。Ccdc33敲低显著降低了GFP-Loc108698169在MCC纤毛末端的荧光强度，表明二者存在功能关联。基于这些数据，研究人员将该蛋白命名为Jhc1。
**（二）Jhc1在非哺乳类脊椎动物中保守且与Thtpa结构相似**
BLASTp搜索显示，Jhc1相关蛋白存在于两栖类、爬行类、软骨鱼和硬骨鱼等多种脊椎动物中，但在哺乳动物和非脊椎动物中缺失。基因组共线性分析证实，爪蟾jhc1基因位于染色体8上ralgps1.L基因的第一个内含子内，且该基因组位置在鱼类和爬行类中精确保守，而人类和小鼠的该共线性区域中不存在Jhc1基因。PSI-BLAST搜索发现Jhc1与Thtpa存在较远的进化关系。二级结构比较显示Thtpa与Jhc1高度相似，但Jhc1包含两个Thtpa所没有的中央 intrinsically disordered regions（IDRs）。AlphaFold3预测显示爪蟾Thtpa采用封闭的β-桶构象，而爪蟾Jhc1则被预测采用开放构象，斑马鱼和短吻鳄的Jhc1同源物也呈现类似的开放结构。HHPred搜索以爪蟾Jhc1为查询序列，在整个人类蛋白质组中仅返回Thtpa为显著命中；FoldSeek结构搜索同样仅识别出Jhc1和Thtpa蛋白与爪蟾Jhc1相似。系统发育分析将Jhc1置于一个支持度高的单系分支中，与Thtpa明显区分。
**（三）Jhc1在多纤毛组织中特异性表达**
全胚原位杂交显示，jhc1在爪蟾胚胎的表皮MCC和前肾肾小管口MCC中表达，且表皮中的特异性表达通过乙酰化微管蛋白共标记得到确认。相比之下，thtpa并未在MCC中富集，而是在整个胚胎中呈现微弱而广泛的表达。单细胞RNA-seq数据证实Jhc1仅在MCC谱系中强表达，而Thtpa则在多能祖细胞和基底细胞中广泛富集但不在MCC中表达。ChIP-seq分析发现jhc1启动子区域被Rfx2和Foxj1（驱动MCC分化的关键转录因子）强结合，而Rfx2敲低后Foxj1在jhc1启动子上的结合消失，表明jhc1受保守的MCC转录调控回路控制；thtpa启动子则不被这些因子结合。
**（四）Jhc1是爪蟾MCC纤毛远端结构和纤毛长度所必需的**
Jhc1敲低导致纤毛长度缩短（减少超过5微米）以及Spef1标记的中夹对延伸部分丢失（减少约1微米）。爪蟾Jhc1重新表达可挽救纤毛长度和Spef1定位缺陷，证实了敲低的特异性。相反，Thtpa表达不能挽救Jhc1敲低导致的纤毛长度或Spef1定位异常，表明Jhc1的分子功能与Thtpa不同。Jhc1缺失还使EDT区域Ccdc33和Ccdc78的富集强度减少约一半，表明Jhc1是EDT的组成成分，与Ccdc33和Ccdc78功能性相互作用以控制MCC纤毛远端结构和纤毛长度。
**（五）Jhc1的纤毛功能和定位在鱼类和爬行类中保守**
斑马鱼jhc1基因敲除系（crispants）中观察到心脏水肿和体轴缩短弯曲等典型的运动纤毛缺陷表型，且基因分型确认表型胚胎中稳定出现INDEL突变。将斑马鱼和短吻鳄的Jhc1在爪蟾MCC中表达后，二者均能正确定位于EDT区域。功能互补实验表明，鱼类和短吻鳄的Jhc1均能有效挽救Jhc1敲低导致的Spef1定位异常和纤毛长度缺陷，证明Jhc1的定位和功能在蛙类、鱼类和爬行类中进化保守。
**（六）Thtpa的催化残基在Jhc1中缺失**
CYTH结构域蛋白（包括Thtpa）的催化机制需要二价金属阳离子（通常为Mg2?）由第一个β-折叠中的ExExK基序配位。该基序在从哺乳动物到两栖动物乃至Nematostella的Thtpa中高度保守，两个不变的谷氨酸残基被预测结合Mg2?。然而，该基序在鱼类、两栖类和爬行类的Jhc1同源物中高度退化——爪蟾Jhc1中不变谷氨酸残基被精氨酸和谷氨酰胺取代，AlphaFold3建模显示这些残基无法与Mg2?形成相互作用。更关键的是，Thtpa催化位点核心的碱性残基——精氨酸55、精氨酸57和赖氨酸69在从Nematostella到人类的Thtpa中均不变，并直接与底物三磷酸基团相互作用。而Jhc1同源物中，不变的正电荷赖氨酸69被不变的负电荷疏水残基（甲硫氨酸或异亮氨酸）取代，不变的正电荷精氨酸55被不变的中性残基取代。这些改变预计足以消除催化活性，但AlphaFold3预测这些残基在爪蟾Jhc1开放结构的同一面上彼此邻近。
**（七）Thtpa中催化必需残基在Jhc1中执行纤毛定位功能**
基于Jhc1可能由Thtpa复制后新功能化而来的假说，研究人员提出三个预测并逐一验证。第一，Jhc1应演化出不同的相互作用伙伴——质谱实验证实Jhc1与EDT蛋白Ccdc33相互作用，AlphaFold3预测该相互作用是直接的。第二，Jhc1与Ccdc33相互作用的残基在具有Jhc1同源物的动物中应受进化约束而在其他动物中不受约束——序列比对显示，鱼类、两栖类和爬行类中Ccdc33的Jhc1相互作用区域含有一对不变的正电荷残基和一段不变的中性柔性谷氨酰胺序列，而哺乳动物中这两个正电荷残基均被中性谷氨酰胺取代，且下游一个谷氨酰胺被刚性的脯氨酸取代。第三，Jhc1中与Thtpa分化的残基可能在其纤毛功能中发挥重要作用——Thtpa催化关键的赖氨酸69在Jhc1中变为异亮氨酸，该残基伸入Jhc1与Ccdc33的预测相互作用界面。将Jhc1的异亮氨酸69回复突变为赖氨酸（I69K）完全消除了Jhc1在爪蟾纤毛EDT的定位，但不影响蛋白稳定性。
**五、讨论与结论**
本研究揭示了此前未被表征的蛋白Jhc1在爪蟾MCC纤毛极远端末端的组织塑造中发挥关键作用。Jhc1通过控制其它EDT蛋白的正常定位以及中夹对延伸中微管捆绑蛋白Spef1的定位来调控纤毛长度。结构分析和序列比对表明Jhc1与Thtpa（一种在所有真核生物谱系中均有研究的酶）共享保守的二级结构，但Jhc1在哺乳动物和非脊椎动物中缺失。Jhc1与Ccdc33结合界面序列的系统发育分布提示在具有Jhc1的物种中存在共进化。研究数据支持Jhc1由Thtpa在进化过程中丢失保守催化残基并新功能化而来，其中一个改变的残基对Jhc1的EDT定位至关重要。
Jhc1在哺乳动物中的缺失可能为不同物种纤毛远端区域的结构差异提供线索——爪蟾胚胎上皮MCC纤毛末端具有球状结构，而哺乳动物气管MCC纤毛末端呈现与中夹对和微管双联体连接的扁平板状结构。尽管爪蟾和小鼠的运动纤毛均表达Ccdc78和Ccdc33等末端蛋白，但形态学差异可能源于包括Jhc1在内的不同组分参与末端复合物的构建。该研究为理解运动纤毛末端的进化和多样性提供了新见解。
**研究结论**：Jhc1是一种源自Thtpa的伪酶，仅存在于非哺乳类脊椎动物中，定位于MCC运动纤毛的极远端末端，通过其与Ccdc33的相互作用调控纤毛远端结构和纤毛长度。Thtpa催化关键残基在Jhc1中的丢失促进了蛋白-蛋白相互作用和EDT定位，代表了运动纤毛远端结构在脊椎动物进化中多样化的一种分子机制。
