磷脂酰丝氨酸合成通过磷脂稳态调控IP3R介导的内质网Ca2+释放

《Cell Reports》：Phosphatidylserine synthesis tunes IP3R-mediated ER Ca2+ release via phospholipid homeostasis

　　

磷脂组成调控对细胞稳态至关重要。在内质网（ER）中合成的磷脂酰丝氨酸（PS）在质膜和内溶酶体系统中发挥关键作用。尽管PS代谢异常与多种疾病相关，但其细胞效应仍知之甚少。在此，研究人员揭示了PS在维持Ca²⁺稳态中的保守功能。果蝇中PS缺乏导致线粒体损伤，而降低肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）介导的内质网Ca²⁺释放可逆转该损伤。值得注意的是，在具有病理性PS水平的哺乳动物细胞中——无论是缺乏还是过量（如Lenz-Majewski综合征）——IP3R激活导致振荡性或减弱的ER表面Ca²⁺释放，与稳态条件下的释放形成鲜明对比。通过果蝇中磷脂酰乙醇胺（PE）-SREBP轴和哺乳动物中磷脂酰胆碱（PC）-SREBP轴调控磷脂组成，可在PS缺乏期间使IP3R介导的Ca²⁺释放正常化。这些发现确立了IP3R介导的ER Ca²⁺释放调控作为PS的关键功能，并为治疗脂质代谢疾病提供了治疗策略。

磷脂酰丝氨酸合成调谐IP3R介导的内质网钙释放：磷脂稳态的关键调控机制

**一、研究背景与科学问题**

生物膜由精密排列的磷脂分子构成，不仅分隔细胞内不同空间，还作为代谢物交换和信号转导的平台，深刻影响膜上发生的各类生化反应。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）虽然丰度相对较低，却是细胞生存所必需的关键磷脂。内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）是PS生物合成的主要场所：PS合成酶1（PSS1）以磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）为底物合成PS，而PSS2则以磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）为底物。新合成的PS随后通过ER建立的膜接触位点运输至各种细胞区室。在含量最丰富的质膜（Plasma Membrane，PM）上，PS参与凋亡、凝血级联反应和低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein，LDL）介导的胆固醇摄取等过程。在线粒体中，PS作为PE合成的前体，对线粒体完整性至关重要。PS代谢异常常见于多种病理生理状态，包括脂肪肝疾病、骨骼成熟延迟和神经退行性疾病。然而，PS在这些疾病中的生理功能及其作用机制尚未完全阐明。

钙离子（Ca²⁺）信号协调多种细胞和生理过程。ER作为主要的细胞内Ca²⁺储存库，通过由泵和通道组成的精密离子转运系统协调这一信号。肌浆/内质网Ca²⁺-ATP酶（Sarco/ER Ca²⁺-ATPase，SERCA）将胞质Ca²⁺泵入ER腔，而肌醇1,4,5-三磷酸受体（Inositol 1,4,5-trisphosphate Receptor，IP3R）和兰尼碱受体（Ryanodine Receptor，RyR）等通道则将其释放至胞质。IP3R是ER膜上广泛表达的Ca²⁺通道，其开放需要同时结合IP3和Ca²⁺。IP3R介导的ER Ca²⁺释放对线粒体代谢、溶酶体功能、自噬体进程和神经元兴奋性等多种细胞过程至关重要。然而，膜脂质如何调控IP3R活性和Ca²⁺释放仍不清楚。

本研究旨在阐明PS代谢如何通过磷脂稳态调控IP3R介导的ER Ca²⁺释放，并探索其在脂质代谢疾病中的潜在治疗价值。研究发表于《Cell Reports》。

**二、研究内容与主要技术方法**

研究人员采用多学科交叉策略，综合利用以下关键技术方法：（1）基于表型的RNAi遗传筛选：在果蝇唾液腺中利用UAS-Gal4系统进行大规模基因筛选，从632个基因中鉴定PS缺乏导致线粒体损伤的抑制因子；（2）脂质组学分析：采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术对果蝇唾液腺和哺乳细胞纯化ER进行磷脂谱分析；（3）定量蛋白质组学：采用串联质谱标签（TMT）标记结合液相色谱-质谱联用技术分析蛋白表达变化；（4）CRISPR-Cas9基因编辑：构建PTDSS1/PTDSS2双突变HeLa细胞系（Dmut）及携带Lenz-Majewski综合征（Lenz-Majewski Syndrome，LMS）相关Q353R突变的SUM159细胞系；（5）活细胞Ca²⁺成像：利用Fluo-3 AM、GCaMP6f-CYB5、Rhod-2 AM、4mtD3cpv和D1ER等荧光探针进行胞质、ER表面、线粒体Ca²⁺水平的实时动态监测；（6）高压冷冻电镜技术观察细胞器超微结构。

**三、主要研究结果**

**1. Pss敲低导致的线粒体缺陷可通过调控PE-SREBP通路得以挽救**

研究人员发现，果蝇中敲低编码PS合成酶的Pss基因导致线粒体损伤，表现为线粒体基质标志物mitoEYFP信号几乎完全消失，外膜标志物mito.OMM信号减少且分布不均，同时线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和三羧酸（TCA）循环相关蛋白水平降低。脂质组学分析显示，Pss敲低组织中PS含量降至野生型的20%，PE种类显著积累。通过靶向敲低PE合成途径中的关键酶——bbc（催化从头合成PE和PC最后一步的酶）和eas（编码乙醇胺激酶）——可恢复mitoEYFP信号至野生型水平。相反，PC合成途径相关酶（CG2201和Pcyt1）的敲低或过表达均无此效果。进一步研究发现，过表达组成性活性的C端缺失型SREBP（SREBP.Cdel）可完全恢复mitoEYFP信号，而过表达全长SREBP则无效，这与PE介导的SREBP反馈抑制机制一致。主成分分析（PCA）显示，bbc敲低和SREBP.Cdel过表达呈现几乎平行的拯救轨迹，表明PE-SREBP轴作为稳态调节器在Pss敲低下恢复膜脂质组成。

**2. ER-线粒体Ca²⁺转运介导PS减少诱导的线粒体损伤**

基于RNAi的抑制因子筛选鉴定出35个（5.5%）能有效恢复mitoEYFP信号的抑制因子。基因本体（GO）分析显示其中91%富集于囊泡介导转运、跨膜离子/代谢物转运和脂质代谢等过程。抑制因子分为三类：I类呈野生型样线粒体模式，II类为核周聚集，III类为胞质聚类。I类抑制因子编码ER-线粒体Ca²⁺转运机器的核心组分，包括Marf（哺乳动物Mfn2同源物）、Itpr（编码IP3R）、porin（编码VDAC同源物）和MCU（编码线粒体Ca²⁺单向转运体）。敲低这些基因均可强烈抑制Pss RNAi细胞的线粒体缺陷。Rhod-2 AM染色证实Pss RNAi组织中Ca²⁺mito水平显著升高，而同时敲低Marf或Itpr可大幅减弱Rhod-2阳性信号。这些结果表明PS减少导致的线粒体损伤源于ER-mito Ca²⁺转运失调。

**3. Pss敲低组织的线粒体损伤可能源于IP3R介导的ER Ca²⁺异常释放**

利用ER-GCaMP6报告基因监测发现，Pss RNAi组织中ER基础荧光强度降低，细胞内囊泡样结构消失。RFP-KDEL标记显示ER形态异常，电镜观察发现ER肿胀破碎。研究人员构建了mCherry-Itpr敲入果蝇品系，发现Pss RNAi组织中IP3R形成大量高强度聚集体，而同时敲低bbc或过表达SREBP.Cdel可消除这些聚集体。结果表明PS合成减少引起的ER脂质组成紊乱导致IP3R异常释放ER Ca²⁺，进而引起线粒体损伤。

**4. PS合成酶参与哺乳动物细胞ER Ca²⁺稳态调控**

通过CRISPR-Cas9技术构建PTDSS1和PTDSS2双突变Dmut细胞系，脂质组学确认PS水平显著降低，外源PS补充可恢复。FRET探针检测显示Dmut细胞基础ER Ca²⁺池耗竭，PS补充可完全恢复。Fluo-3检测发现ATP刺激后Dmut细胞出现振幅较小但频率显著升高的Ca²⁺尖峰。TG处理后Dmut细胞Fluo-3信号低于对照，提示ER Ca²⁺储备减少可能是PS合成降低时ER Ca²⁺过度释放的结果。

**5. PS减少诱导ER表面IP3R介导的Ca²⁺振荡**

利用ER表面靶向Ca²⁺探针GCaMP6f-CYB5，研究人员发现在无Ca²⁺培养基中ATP刺激下，Dmut细胞呈现Ca²⁺振荡模式，而野生型细胞为单次尖峰。重新表达PTDSS1或PTDSS2可减少振荡，同时表达两者可恢复至野生型样单次尖峰。外源PS补充呈剂量依赖性拯救振荡表型。组胺激活内源性Gq偶联H1受体同样诱导振荡反应，外源PS可抑制。PLC抑制剂U73122和IP3R抑制剂2-APB浓度依赖性抑制振荡性Ca²⁺释放。单独敲低IP3R1、IP3R2或IP3R3均有抑制效果，三者联合敲低显著抑制振荡。抑制SERCA2活性可将振荡恢复为单次尖峰，证实SERCA介导的ER Ca²⁺库再充填对振荡维持至关重要。

**6. PC-SREBP轴调控挽救PS减少引起的振荡性Ca²⁺释放**

脂质组学分析显示Dmut细胞纯化ER中总PC水平大幅升高，总PE水平显著降低。敲低PCYT1A（PC合成关键酶）或PEMT（PE转化为PC的酶）均可抑制振荡性Ca²⁺释放，形成野生型样Ca²⁺信号模式。过表达组成性活性的SREBP1 N端同样抑制Dmut细胞Ca²⁺振荡。外源PS补充不仅恢复PS水平，还显著降低Dmut细胞升高的PC水平。由于磷脂水平以总极性脂质归一化，这表明PS补充通过恢复整体脂质组成平衡而非单纯补充PS本身来挽救表型，支持磷脂失衡模型。

**7. LMS致病性PTDSS1突变降低IP3R介导的Ca²⁺释放**

构建携带LMS相关Q353R突变的SUM159细胞系（GOF细胞），脂质组学确认总PS水平升高。虽然线粒体形态和Ca²⁺水平正常，但ATP刺激后GOF细胞产生较低振幅且消散较慢的Ca²⁺尖峰。ER表面监测显示GOF细胞Ca²⁺尖峰振幅和积分面积均降低。在SC8细胞中稳定表达PTDSS1-Q353R同样显著减弱ATP诱导的IP3R介导Ca²⁺释放，峰值振幅降低约50%，积分面积降低约60%。这些结果证实PS合成过量减弱IP3R介导的Ca²⁺信号。

**四、讨论与结论**

本研究揭示了PS合成通过调控ER膜磷脂组成来精密调谐IP3R介导的Ca²⁺释放。在果蝇中，PS缺乏导致PE积累、IP3R聚类和线粒体损伤；在哺乳细胞中，PS缺乏导致ER中PC积累和IP3R激活后Ca²⁺振荡。尽管累积的磷脂种类不同，两个系统均汇聚于ER膜脂质环境紊乱影响IP3R门控的机制。物种特异性差异可能反映PSS底物偏好和细胞类型特异的代谢网络差异。外源PS补充通过恢复整体脂质平衡而非单纯补充PS本身挽救表型，提示磷脂失衡而非特定脂质种类的缺失是驱动IP3R功能障碍的保守决定因素。PS可能通过直接结合IP3R或间接改变膜生物物理特性（流动性、曲率或张力）来调控IP3R构象。PS与磷酸肌醇（PIPs）的功能交织暗示PS介导的IP3R调控可能嵌入更广泛的磷脂信号网络中。IP3R介导的Ca²⁺释放调控多种细胞过程，PS-IP3R-Ca²⁺轴可能延伸至多种疾病背景，包括代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD）、LMS和PTDSS1扩增的癌症。该研究确立了ER Ca²⁺释放调控作为PS的关键功能，为治疗脂质代谢疾病提供了新策略，并提示靶向Ca²⁺信号可能是PS相关代谢疾病和肿瘤治疗的潜在途径。

**研究结论**：PS合成水平通过调控ER膜脂质组成来调谐IP3R介导的Ca²⁺释放动力学。PS缺乏在果蝇和哺乳动物中均导致异常IP3R激活——果蝇中表现为线粒体损伤，哺乳动物中表现为Ca²⁺振荡；而PS过量（如LMS）则减弱Ca²⁺释放。通过调控PE-SREBP轴（果蝇）或PC-SREBP轴（哺乳动物）恢复磷脂平衡可正常化IP3R介导的Ca²⁺释放。这些发现确立了PS在ER Ca²⁺稳态中的保守功能，为理解脂质代谢疾病的病理机制和开发靶向Ca²⁺信号的治疗策略提供了理论基础。