PLCd4信号介导的PI4P合成驱动巨噬细胞NLRP3炎症小体激活以促进热射病诱导的组织损伤

《Cell Reports》：PLCd4 signaling-mediated PI4P synthesis drives macrophage NLRP3 inflammasome activation to promote heat stroke-induced tissue injury

　　

热射病（heat stroke）引起危及生命的全身性炎症和多器官损伤，但热暴露后维持炎症放大的细胞内机制仍不清楚。在此，研究人员利用热射病小鼠模型、遗传性NLRP3缺失、药理学抑制、髓系特异性NLRP3缺陷、巨噬细胞耗竭以及热应激巨噬细胞系统，表明组织巨噬细胞NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）激活是白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）/白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）释放、器官损伤和死亡率的中心驱动因素。机制上，热射病增强磷脂酶C delta 4（phospholipase C delta 4, PLCd4）信号，促进反式高尔基体网络（trans-Golgi network, TGN）/高尔基体相关膜上的二酰甘油（diacylglycerol, DAG）积累，招募蛋白激酶D1（protein kinase D1, PKD1），并增加磷脂酰肌醇4-激酶β（phosphatidylinositol 4-kinase β, PI4KB）依赖的磷脂酰肌醇4-磷酸（phosphatidylinositol 4-phosphate, PI4P）产生。这种脂质重塑支持NLRP3招募、ASC斑点（ASC speck）形成、caspase-1激活和炎症细胞因子释放。磷脂酶C delta 4敲低优先抑制热射病诱导的NLRP3激活，但不抑制经典刺激诱导的激活。这些发现将热射病与膜脂质重塑和空间炎症小体组装联系起来，确定了一条潜在的热射病器官保护通路。

**论文解读：热射病通过PLCd4信号介导的PI4P合成驱动巨噬细胞NLRP3炎症小体激活促进组织损伤**

**一、研究背景与问题**
全球变暖和城市热岛效应导致持续性热浪频率增加，显著提高了热射病（heat stroke, HS）及热相关住院风险。HS是一种危及生命的疾病，由热应激诱发，可导致全身性炎症和多器官损伤；若未及时处理，可进展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），严重恶化患者预后。临床和病理研究表明，炎症在HS发生和进展过程中持续存在，并可能在降温后继续促进器官损伤。然而，驱动HS后全身多器官炎症的机制仍不清楚。此前研究显示，NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体介导的炎症参与HS诱导的肝损伤，但其在全身多器官损伤中的作用和机制尚不明确。NLRP3炎症小体激活的关键早期步骤是其招募至磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）富集的细胞内膜结构，包括反式高尔基体网络（TGN）/分散TGN（dTGN）和内涵体相关膜。PI4P作为关键磷脂，不仅富集于TGN和TGN衍生囊泡，也存在于某些内涵体、质膜和溶酶体相关膜结构，参与细胞信号转导、膜运输和脂质稳态。因此，明确HS是否重塑特定PI4P膜池，以及这种脂质变化是否参与巨噬细胞NLRP3炎症小体激活，对理解HS后持续炎症至关重要。

**二、研究内容与结论**
研究人员利用HS小鼠模型、遗传性NLRP3缺失（Nlrp3^-/-）、药理学抑制（MCC950）、髓系特异性NLRP3缺陷（Lyz2-Cre;Nlrp3^fl/fl）、巨噬细胞耗竭（氯膦酸二钠脂质体）以及体外热应激巨噬细胞系统，系统揭示了组织巨噬细胞NLRP3炎症小体激活是HS后IL-1β/IL-18释放、多器官损伤和死亡率的中心驱动因素。机制上，HS增强磷脂酶C delta 4（PLCd4）信号，促进TGN/高尔基体相关膜上二酰甘油（DAG）积累，招募蛋白激酶D1（PKD1），并增加磷脂酰肌醇4-激酶β（PI4KB）依赖的PI4P产生。PI4P富集的膜结构进一步支持NLRP3招募、ASC斑点形成、caspase-1激活和IL-1β/IL-18释放。PLCd4敲低优先抑制HS诱导的NLRP3激活，但对经典刺激（如ATP、尼日利亚霉素、二氧化硅）诱导的NLRP3激活影响有限。这些发现将HS与膜脂质重塑和空间炎症小体组装联系起来，识别出一条潜在的热射病器官保护通路。该论文发表在《Cell Reports》。

**三、主要关键技术方法**（不超过250字）
主要方法包括：热射病小鼠模型（39.5°C，相对湿度65%，核心体温≥42.5°C）；基因敲除小鼠（Nlrp3^-/-、Lyz2-Cre;Nlrp3^fl/fl）；药理学抑制剂（MCC950、U73122、CRT0066101、PI-273等）；巨噬细胞耗竭（氯膦酸二钠脂质体）；骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和J774A.1细胞热应激处理（43°C 2h后恢复）；慢病毒/AAV9介导的基因敲低和过表达；免疫荧光共定位分析（使用PI4P探针OSBP-PH-GFP/mCherry、DAG探针mCherry-DAG）；免疫共沉淀和体外激酶实验；流式细胞术检测活性caspase-1；ELISA检测IL-1β/IL-18；组织病理学评估；预先存在的单细胞RNA-seq数据集重分析（来源：研究人员课题组先前生成的小鼠肝脏巨噬细胞/单核细胞scRNA-seq数据）。

**四、研究结果**

**1. HS诱导组织巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活并促进多器官损伤**
通过检测HS后小鼠心、肝、肺、肾组织中Nlrp3和Il1b mRNA水平升高，免疫荧光显示F4/80阳性巨噬细胞中NLRP3和IL-1β信号增强。利用Nlrp3^-/-小鼠，发现NLRP3缺失显著降低组织巨噬细胞中NLRP3/IL-1β共定位、血浆IL-1β/IL-18水平、组织病理损伤、器官损伤标志物（ALT、AST、BUN、CK、LDH）并改善72小时生存率。NLRP3抑制剂MCC950和髓系特异性NLRP3缺陷（Nlrp3^ΔMye）小鼠进一步验证了上述结论。巨噬细胞耗竭（氯膦酸二钠脂质体）同样减轻HS诱导的炎症和组织损伤。这些结果共同表明组织巨噬细胞NLRP3炎症小体激活是HS相关多器官损伤的关键机制。

**2. HS在体外直接诱导巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活**
在BMDMs中，HS刺激时间依赖性增加NLRP3表达、GSDMD剪切、caspase-1 p20释放、活性caspase-1阳性细胞比例以及IL-1β/IL-18分泌。在固定HS刺激后恢复期间，上述指标持续升高至24小时。免疫荧光显示HS促进NLRP3-ASC共定位和ASC斑点形成。MCC950处理或NLRP3缺失显著抑制ASC斑点形成、caspase-1 p20释放和细胞因子分泌，表明HS可直接诱导巨噬细胞中NLRP3依赖的炎症小体激活。通过比较AIM2和NLRC4炎症小体通路，NLRP3敲低显著抑制HS诱导的炎症反应，而AIM2或NLRC4敲低无显著效果，证实HS诱导的炎症小体激活主要依赖NLRP3。

**3. HS促进PI4KB依赖的PI4P在TGN/高尔基体相关膜结构积累并支持NLRP3炎症小体激活**
利用OSBP-PH-GFP/mCherry PI4P荧光探针，免疫荧光显示HS后细胞内PI4P信号显著增强，PI4P、NLRP3和TGN46三重共定位区域增大。PI4P与高尔基体标志物Golgi97共定位增加，而与早期内涵体标志物EEA1共定位未显著增加，表明HS诱导的PI4P积累主要发生在TGN/高尔基体相关膜结构。通过药理学抑制和shRNA敲低PI4K2A、PI4K2B和PI4KB，发现PI4KB抑制剂或shPi4kb最显著地减少HS诱导的PI4P荧光强度，且PI4KB与TGN46和PI4P共定位增加。功能实验表明，抑制PI4P生成（PI4KB抑制剂或shPi4kb）显著减少ASC斑点形成、caspase-1 p20释放和IL-1β/IL-18分泌，而对总NLRP3蛋白表达影响有限，提示PI4KB主要参与HS下NLRP3炎症小体组装和激活。

**4. PLCd4-DAG-PKD1信号促进PI4KB磷酸化相关的PI4P积累并支持HS诱导的NLRP3炎症小体激活**
通过重新分析预先存在的单细胞RNA-seq数据，发现HS后巨噬细胞中NOD样受体信号通路和PLC相关分子表达变化。免疫荧光显示HS后PKD与TGN46共定位增加。免疫共沉淀和免疫印迹表明HS增强PI4KB的Ser/Thr磷酸化信号，而PKD抑制剂CRT0066101显著降低该信号。PKD1敲低最强烈地抑制HS诱导的PI4KB磷酸化信号，而PKD2和PKD3敲低效果较弱。体外激酶实验显示重组PKD1在ATP存在下增强PI4KB磷酸化，PKD抑制剂减弱该效应。PI4KB S294A突变显著降低PKD1介导的磷酸化信号和功能拯救（恢复PI4P积累、ASC斑点形成、caspase-1激活和细胞因子释放）。进一步筛选PLC亚型，shRNA敲低筛选显示Plcd4敲低最显著抑制HS诱导的caspase-1激活和ASC斑点形成。Plcd4敲低降低HS诱导的DAG信号、DAG与TGN46共定位、PKD招募至TGN46阳性区域、PI4KB磷酸化信号、PI4P积累及IL-1β/IL-18释放。与经典NLRP3刺激对比，Plcd4敲低优先抑制HS诱导的NLRP3激活，对LPS+ATP、尼日利亚霉素或二氧化硅诱导的激活影响有限，表明PLCd4-DAG-PKD-PI4KB通路是HS条件下NLRP3组装的偏好性支持机制，而非通用许可因子。

**5. PLCd4调控HS小鼠组织巨噬细胞NLRP3炎症小体激活和多器官损伤**
体内药理学干预（PLC抑制剂U73122、激动剂m-3M3FBS）显示，U73122减少组织巨噬细胞中F4/80、NLRP3和IL-1β共定位信号、血浆IL-1β/IL-18及器官损伤标志物，减轻组织病理损伤并改善生存；m-3M3FBS则加剧上述参数。通过尾静脉注射AAV9-shPlcd4建立多组织PLCD4敲低模型，Western blot确认心、肝、肺、肾组织中PLCd4蛋白表达降低。与AAV9-shNC组相比，AAV9-shPLCD4显著减少HS后组织巨噬细胞中NLRP3/IL-1β共定位信号、降低血浆IL-1β/IL-18水平、减轻器官损伤标志物升高，改善组织病理损伤并提高72小时生存率。在雌性小鼠中，U73122给药或AAV9-shPLCD4处理同样获得类似保护效果。这些结果支持PLCD4相关信号在HS诱导的NLRP3炎症小体激活和组织损伤中的病理意义。

**五、讨论总结与研究结论**
本研究揭示了HS后炎症持续和多器官损伤进展的机制：巨噬细胞膜脂质重塑驱动NLRP3炎症小体激活。HS诱导的多器官损伤不仅与急性热暴露本身相关，更与巨噬细胞NLRP3炎症小体介导的持续炎症放大密切相关。在体外去除热刺激后，caspase-1激活、GSDMD剪切和炎症细胞因子释放仍持续增加，提示HS后炎症具有一定自我维持活性，这为临床降温后器官功能障碍仍可能恶化的现象提供了机制解释。与经典NLRP3刺激不同，PLCd4-PI4KB轴并非NLRP3炎症小体的通用核心开关，而是HS偏好的NLRP3组装支持机制。HS通过PLCd4-DAG-PKD1-PI4KB信号促进TGN/高尔基体相关PI4P积累，增强NLRP3在PI4P富集膜结构上的空间聚集，从而促进ASC斑点形成和caspase-1激活。尽管PI4KB是本研究检测的主要功能贡献者，但HS诱导的PI4P重塑可能涉及多种PI4K亚型。PKD1与PI4KB的相互作用可能为瞬时或依赖膜环境的方式，PI4KB Ser294磷酸化参与其中。体内药理学和AAV9介导的多组织Plcd4敲低实验支持PLCD4通路在HS损伤中的病理意义及潜在干预价值。

**研究结论**：本研究将热射病与膜脂质重塑和空间炎症小体组装联系起来，确定了一条潜在的热射病器官保护通路。靶向PLCD4-DAG-PKD1-PI4KB-PI4P轴可能为抑制热射病后持续炎症放大提供新的干预策略。