《Cell Reports》：Distinct systemic and gut IgA responses to bacteria of the human upper gastrointestinal tract
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胃肠道黏膜上皮内衬着人体最大的浆细胞群体，其中大部分产生二聚体免疫球蛋白A（IgA）并释放至肠腔。此外，体内还存在循环于血液中的单体IgA的系统性产生。关于系统性IgA与黏膜IgA之间的联系目前知之甚少。为探讨这一关系并研究针对微生物群的抗体反应，研究人员从十
胃肠道黏膜上皮内衬着人体最大的浆细胞群体，其中大部分产生二聚体免疫球蛋白A（IgA）并释放至肠腔。此外，体内还存在循环于血液中的单体IgA的系统性产生。关于系统性IgA与黏膜IgA之间的联系目前知之甚少。为探讨这一关系并研究针对微生物群的抗体反应，研究人员从十二指肠活检组织中分离细菌并评估抗体反应性。系统性IgA显示出对上消化道细菌的反应性，且优先结合奈瑟菌属（Neisseria）物种，而十二指肠IgA则表现出更广泛的反应性。对肠道和骨髓浆细胞进行的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）显示，这两个 compartments 之间的克隆重叠有限。然而，仍鉴定出少数针对细菌抗原的共享克隆。总体而言，肠道和骨髓浆细胞具有不同的V(D)J重组谱系和IgA亚类分布，它们可能依赖于在不同解剖部位发生的B细胞激活。
论文解读
**研究背景与问题**
胃肠道黏膜是人体最大的抗体分泌部位，黏膜固有层中的浆细胞主要产生免疫球蛋白A（IgA）类抗体。这些浆细胞分泌的IgA以二聚体形式通过多聚免疫球蛋白受体（pIgR）转运至肠腔，形成分泌型IgA（secretory IgA, SIgA），在调控肠道菌群组成、细菌定植及代谢产物调节等方面发挥关键作用。与此同时，血液中还存在着主要由骨髓（bone marrow, BM）浆细胞产生的单体形式血清IgA。长期以来，关于黏膜IgA与系统性IgA之间的关系尚不清楚。既往研究主要关注肠道IgA对共生菌群的反应，而血清抗体最初被认为主要靶向系统性病原体。然而，近年来的研究表明血清IgA也能识别共生菌，并可能在黏膜屏障受损时发挥保护作用。人类IgA存在IgA1和IgA2两个亚类，血清IgA以IgA1为主，而黏膜IgA沿胃肠道呈现从近端到远端IgA1:IgA2比例递减的分布特征，这一观察提示系统性IgA可能主要来源于上消化道的免疫反应。然而，这一假说尚未得到直接验证，黏膜与系统性IgA之间的克隆关联和起源位点仍不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在探究系统性IgA与黏膜IgA之间的关系，以及针对上消化道菌群的抗体反应特征。
**研究内容与主要发现**
研究人员从接受内镜检查以检测乳糜泻相关黏膜改变的4名个体的十二指肠活检组织中分离培养细菌，共获得175株分离株，归属于9个细菌属和1种酵母菌（白色念珠菌Candida albicans）。通过流式细胞术检测纯化的血清IgA对固定细菌的结合能力，发现血清IgA对各供体的活检分离株均表现出反应性，但对结肠来源的对照菌株无结合。值得注意的是，奈瑟菌属（Neisseria）菌株在四名供体中均被血清IgA高度识别，其中N. subflava分离株的反应性普遍高于N. flavescens。进一步分析显示，血清IgA对细菌的反应性在一名患者三年内采集的四个时间点血清样本中保持稳定，尤其是对奈瑟菌属的结合最为稳定。
通过酶联免疫斑点（ELISPOT）实验比较同一供体十二指肠活检组织与配对血清样本的IgA反应性，研究人员发现肠道浆细胞的细菌反应模式与血清IgA存在显著差异：肠道浆细胞表现出对大多数测试菌株的广泛反应性，而非优先靶向奈瑟菌属。从十二指肠活检组织中分选并克隆了一个结合S. parasanguinis的浆细胞来源的单克隆抗体（mAb 1629-A01），该抗体不仅结合S. parasanguinis不同菌株，还交叉识别奈瑟菌属物种，提示肠道浆细胞的广泛细菌反应性可能归因于广泛存在的跨物种反应性。
对4名乳糜泻患者的十二指肠活检组织和配对骨髓穿刺样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合CITE-seq分析，研究人员发现肠道和骨髓浆细胞在V(D)J重组谱系、IgA亚类分布、CD27表达、轻链使用及体细胞突变水平等方面均存在显著差异。骨髓浆细胞以IgA1为主，高表达CD27，突变水平更高；肠道浆细胞则IgA1和IgA2约各占一半，且多数扩增克隆局限于单一亚类。转录组分析鉴定出436个差异表达基因（DEGs），包括与骨髓归巢和存活相关的CXCR4、KLF2、TACI（TNFRSF13B）以及肠道归巢相关的CCR10、RGS1等。骨髓浆细胞高表达浆细胞分化相关基因（XBP1、IRF4、CD9、CD38、TXNIP），而肠道浆细胞高表达激活和B细胞受体（BCR）信号相关基因（CD69、CD79A、FOS、JUNB）。值得注意的是，J链（JCHAIN）在肠道浆细胞中的表达水平显著高于骨髓浆细胞，这与肠道浆细胞分泌二聚体IgA而骨髓浆细胞主要分泌单体IgA的现象一致。
尽管两个 compartment 的浆细胞群体大部分克隆不重叠，但在所有四名供体中均鉴定出少量跨越肠道和骨髓的克隆。研究人员从这些共享克隆中表达了10个全长人IgA1单克隆抗体，其中3个抗体（2046-8BM、558-6BM、2046-4BM）显示出对细菌分离株的结合活性。mAb 558-6BM被鉴定为识别大肠杆菌主要外膜脂蛋白（Lpp，即Braun脂蛋白）的脂质-蛋白复合表位；mAb 2046-4BM则特异性识别奈瑟菌属物种，与多克隆血清IgA的反应模式一致。此外，研究人员在13名个体（包括乳糜泻患者和健康供体）中证实了血清IgA对奈瑟菌属的优先反应性，表明这一现象具有普遍性且不依赖于乳糜泻状态。
在探讨细菌逃避免疫识别的机制方面，研究人员检测了30株十二指肠分离株培养上清液对血清IgA的降解或修饰活性，发现1株溶血孪生球菌（Gemella haemolysans）具有IgA蛋白酶活性，能够降解IgA，另有2株婴儿链球菌（Streptococcus infantis）分离株表现出IgA特异性糖苷酶活性，可引起IgA重链分子量轻度改变。这些酶活性均具有IgA特异性，不影响IgG。
**主要技术方法**
本研究采用了多种关键技术：从十二指肠活检组织中通过需氧和厌氧培养分离细菌，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定；利用流式细胞术检测纯化血清IgA对固定细菌的结合反应性；采用ELISPOT检测十二指肠活检组织单细胞悬液中分泌细菌结合性IgA的浆细胞；分选抗原特异性浆细胞后克隆表达重组人IgA1单克隆抗体；利用10x Genomics平台进行液滴式scRNA-seq结合CITE-seq分析浆细胞转录组和表面蛋白表达；通过BraCeR和Change-O等工具进行BCR序列重建和克隆归属分析；采用CytoTRACE 2评估浆细胞分化状态；通过Western blot和ELISA鉴定单克隆抗体靶向的细菌抗原。
**讨论与结论**
本研究表明，系统性IgA针对上消化道特定细菌的选择性产生，其诱导位点与肠道黏膜固有层浆细胞的形成位点不同。研究人员提出，Waldeyer环（包括腭扁桃体和腺样体）所在的鼻咽部和口咽部淋巴组织可能是产生骨髓定居IgA+浆细胞的重要诱导部位，这些浆细胞负责血清IgA的稳定产生。该假说得到以下观察的支持：扁桃体来源的活化B细胞亚群具有不同于肠道相关淋巴组织（GALT）来源B细胞的归巢特性，且已被证明可定居于骨髓。在乳糜泻中，针对自身抗原转谷氨酰胺酶2（TG2）的血清IgA反应依赖于饮食中的麸质，且TG2特异性浆细胞在骨髓中几乎不存在，表明短寿命的血清IgA反应可能由次级淋巴组织中的浆细胞或循环浆母细胞产生，而非骨髓存活龛中的长寿命浆细胞。
值得注意的是，肠道和骨髓共享克隆中骨髓细胞的IgA1/IgA2分布与十二指肠总体浆细胞群体相似，提示这些共享克隆的诱导位点可能是GALT。研究人员推测，GALT中的初始激活可能形成循环记忆细胞，这些细胞在另一部位（如扁桃体）再次遇到相同抗原后可被重新激活并分化为骨髓归巢浆细胞。本研究还发现，细菌可通过分泌IgA修饰酶（蛋白酶和糖苷酶）来逃避免疫识别或调节IgA结合，这可能部分解释了血清IgA对某些菌属（如孪生球菌属和链球菌属）反应性较低的现象。
**研究结论**
综上所述，该研究证明了系统性IgA针对上消化道特定细菌的选择性产生机制，这些抗体反应依赖于与肠道固有层浆细胞不同的诱导位点。上呼吸消化道淋巴组织可能对产生骨髓定居浆细胞尤为重要，后者负责血清IgA的稳定产生。分泌型IgA和系统性IgA的差异性形成对黏膜疫苗的开发具有重要意义——如果同时需要系统性和肠道黏膜保护，可能有必要同时靶向扁桃体和肠道相关淋巴组织。该研究论文发表在《Cell Reports》。
**研究局限性**
研究人员指出，肠道与骨髓浆细胞的比较基于少数供体样本，但同种型使用、克隆重叠和基因表达谱在四名供体中保持一致，表明研究结果可能代表一般规律。培养方法仅能获得可培养的细菌，且体外培养可能导致细菌表型改变。使用完整固定细菌评估抗体反应性仅限于表面暴露抗原，但已有研究表明大多数细菌反应性黏膜浆细胞针对细胞壁和膜相关抗原。
