分布式克隆删除阻止自身免疫疾病进展

《Cell Reports》：Distributed clonal deletion prevents autoimmune disease progression

　　

自身反应性B细胞在发育过程中产生，并可通过激活诱导胞苷脱氨酶（AID）介导的多样化增强致病性。克隆删除被认为可消除这些细胞，然而删除如何在发育和活化阶段分布以阻止自身免疫疾病仍不清楚。在此，研究人员展示了自身耐受通过时间上不同的线粒体外膜通透化（MOMP）检查点得以执行。利用条件性Bcl-2表达从B细胞发育或活化阶段抑制MOMP，研究人员发现早期抑制允许自身反应性B细胞在外周输出后存活，扩大了可用于活化和AID依赖性多样化的细胞库。这导致类别转换的IgG自身反应性广度增加、补体激活、肾脏病理，并驱动致死性自身免疫疾病。相比之下，活化后MOMP抑制促进自身反应性细胞积累和自身抗体产生，但仅造成有限的组织损伤和正常的生存率。总之，这些发现支持一种分布式克隆删除模型，其中时间上不同的检查点协同约束自身免疫疾病进展。

**研究背景与问题**

系统性自身免疫疾病如系统性红斑狼疮（SLE）的发病机制涉及免疫耐受失效，B细胞产生靶向自身组织的抗体。尽管健康个体中自身反应性B细胞普遍存在，但多数人并不产生致病性自身抗体，且部分个体即使产生自身抗体也不发展为疾病。这种从自身反应性B细胞、自身抗体到自身免疫疾病的三级耐受机制尚未完全阐明。B细胞发育过程中，骨髓中的VDJ重组产生多样化前免疫库，未成熟B细胞离开骨髓后经过渡阶段进入脾脏滤泡或边缘区。长期以来一个未解问题是：注定被删除的未成熟B细胞是在骨髓内还是外周输出后死亡？此外，活化后B细胞通过AID介导的体细胞高频突变（SHM）和类别转换重组（CSR）可能产生或增强自身反应性，但不同发育和活化阶段的凋亡检查点如何协同阻止疾病进展仍不清楚。既往研究多关注单一检查点，未直接比较检查点失效时机对自身反应性向疾病进展的影响。

**研究内容与结论**

研究人员利用相同的Rosa26LSL?Bcl2等位基因，通过不同Cre重组酶实现Bcl-2在B细胞发育早期持续表达（Bcl2Early）或仅在活化后表达（Bcl2Late），从而抑制MOMP。研究发现：仅Bcl2Early小鼠发生临床疾病，表现为存活率降低（雌性更严重）、肾小球肾炎、补体C3d沉积和肾功能损害；Bcl2Late小鼠虽有自身抗体和肾小球Ig沉积，但无补体激活和组织损伤。自身抗原阵列分析显示Bcl2Early小鼠IgG自身反应广度显著增加（23个显著反应，对比Bcl2Late的5个），而IgM自身反应相似。AID缺失完全阻止Bcl2Early小鼠的自身免疫疾病，表明AID依赖性多样化是致病必需。细胞动力学分析显示，早期MOMP抑制扩增脾脏过渡期（T1、T2）、无能（T3）和滤泡（FO）B细胞，但不影响骨髓未成熟B细胞，提示主要克隆删除检查点位于外周输出后。EdU脉冲追踪鉴定过渡期B细胞为第一个受MOMP限制的发育阶段。Bcl2Int（CD21Cre介导的FO内在抑制）模型显示FO内在抑制不足以解释完整表型。

**主要技术方法**

研究采用条件性基因敲入小鼠模型（Bcl2Early和Bcl2Late），结合流式细胞术分析B细胞亚群、EdU脉冲追踪标记评估发育动力学、血管内标记（anti-CD45R/B220-PE-Cy7）检测骨髓输出、自身抗原微阵列（涵盖多种自身抗原）和噬菌体免疫沉淀测序（PhIP-seq）分析自身抗体谱、肾脏病理学评分（H&E染色和免疫荧光）、ELISA检测血清自身抗体和尿素水平。小鼠品系均基于C57BL/6背景，在NCI动物设施SPF条件下饲养。

**研究结果**

**1. 早期而非晚期MOMP抑制引起自身免疫疾病**：Bcl2Early小鼠出现肾小球肾炎、补体沉积和尿素升高，Bcl2Late小鼠仅有关节外Ig沉积而无病理改变。

**2. Bcl-2从B细胞发育阶段表达限制IgG自身抗体广度**：Bcl2Early小鼠IgG自身反应广度扩大（23个显著反应），包括抗C3和抗PCNA（与严重狼疮肾炎相关），而IgM广度在两组间相似。

**3. AID是早期MOMP抑制下自身免疫病理所必需的**：Bcl2EarlyAicda?/?小鼠无自身免疫疾病和肾损伤，表明CSR/SHM对致病性至关重要。

**4. 活化前MOMP抑制扩增外周B细胞群**：Bcl2Early小鼠脾脏T1、T2、T3和FO B细胞显著增加，骨髓未成熟B细胞不变，Bcl2Late小鼠类似对照。

**5. 未成熟B细胞删除主要发生在骨髓输出后**：血管标记实验排除加速骨髓输出，Gsdmd?/?Gsdme?/?Mlkl?/?三敲除小鼠排除焦亡和坏死性凋亡的作用。

**6. 过渡期B细胞是MOMP调控的第一个外周阶段**：EdU追踪显示Bcl2Early小鼠中T1、T2、T3细胞在第三天显著增加并持续至第七天，FO和Fraction F细胞第七天扩增。

**7. FO内在MOMP抑制不足以解释外周扩增**：Bcl2Int小鼠FO增加但少于Bcl2Early，过渡期和T3细胞无变化。

**讨论与结论**

研究提出“分布式克隆删除模型”（Distributed Clonal Deletion Model），认为克隆删除分布在活化前和活化后阶段：早期外周检查点限制低亲和力自身反应性B细胞进入免疫应答，后期检查点约束活化克隆的持久性。早期检查点失效扩大可多样化细胞库，导致AID依赖的致病性自身抗体反应；晚期检查点失效仅允许自身反应性而无疾病进展。Ig沉积在两组均有但补体激活仅在早期间，表明自身抗体组成而非总量决定组织损伤。AID缺失的完全保护效应表明，在此模型中AID的致病作用超过其潜在的耐受促进作用。研究结果对理解人类自身免疫病具有意义：早期耐受缺陷可能扩大致病性多样化库，靶向早期删除或限制类别转换和补体激活可能优于全局B细胞清除。局限性包括：Bcl-2抑制MOMP但可能影响其他过程；未区分SHM和CSR的相对贡献。