比色LAMP法与PCR法在高危HPV检测中的比较：对宫颈癌筛查的启示

《Journal of Neurologic Physical Therapy》：Comparison of Colorimetric LAMP and PCR for High-risk HPV Detection: Implications for Cervical Cancer Screening

　　目标：宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起，通常通过基于聚合酶链反应（PCR）的检测方法来诊断。不过，这些方法耗时较长且需要专用设备。本研究旨在评估环介导等温扩增（LAMP）检测作为传统PCR检测的快速替代方法的诊断性能。

方法：本研究纳入了933名19岁及以上的非孕妇，她们因宫颈癌筛查或随访而接受了HPV检测。检测所涉及的HPV类型包括14种高危型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）。宫颈拭子样本经过核酸提取后，使用类型特异性引物进行LAMP扩增。反应在63℃下进行35分钟，结果通过颜色变化来判断（蓝色表示阳性，紫色表示阴性）。

结果：与PCR相比，LAMP检测对16型和18型HPV的敏感度为97.8%（95%置信区间：94.4–100.0），而对其他高危型HPV的敏感度则为100.0%（95%置信区间：98.8–100.0）。所有类型的特异性均为100.0%（95%置信区间：98.8–100.0）。总体诊断准确率为99.5%（95%置信区间：99.0–100.0）。当同时分析全部14种HPV类型时，临床敏感度和特异性分别为99.4%和100.0%。

结论：LAMP检测是一种快速、简单且准确的HPV检测方法，可作为一种有用的现场筛查工具，尤其是在资源有限的地区。在全球范围内，宫颈癌无论是从发病率还是死亡率来看，都是女性中第四大常见恶性肿瘤。自20世纪90年代以来，人乳头瘤病毒DNA检测已成为早期发现宫颈癌的主要方法，其敏感度高于传统巴氏涂片检查，且更具客观性。迄今为止，已鉴定出约200种不同的HPV基因型，其中约40种具有生殖器上皮亲和性。在这些基因型中，16型、18型、31型和45型与宫颈癌的关联最为密切。特别是在美国和欧洲，16型HPV导致了近50%的宫颈癌病例，而18型、31型和45型则共同导致了另外25%–30%的病例。临床上常用的HPV检测方法包括非扩增技术，如Southern blotting、原位杂交和液体杂交，以及扩增技术，包括类型特异性PCR、通用引物PCR和实时PCR。其中，实时PCR在临床应用最为广泛，但其缺点包括检测时间超过2小时、设备成本高以及需要专业技术人员。为解决这些问题，环介导等温扩增技术被作为一种替代性的诊断方法引入。与依赖热循环的实时PCR不同，LAMP在等温条件下运行，通常在60分钟内即可完成检测，从而实现更快速的检测结果。此外，LAMP的结果可通过简单的颜色变化直观判断，便于在现场立即得出结论。因此，本研究旨在评估LAMP检测在识别高危HPV类型方面的诊断性能，并将其与基于PCR的检测方法进行比较。总体诊断准确率为99.6%（933份样本中的929份），Cohen kappa系数为0.989，95%置信区间下限为97.8%（表3）。表3：14种高危HPV类型的临床敏感度和特异性汇总

PCR检测仪　阳性　阴性　总计
14种HPV类型　14　68　60　686
阴性　42　43　247
总计　69　0　243　933

敏感度（%）[95%置信区间]　99.4% (1) [98.8–100.0] (2) [98.6–99.8] (3) [98.5–99.8]
特异性（%）[95%置信区间]　100.0% (1) [99.8–100.0] (2) [99.0–100.0] (3) [98.5–100.0]
Cohen kappa指数（%）[95%置信区间]　98.9% [97.8–100.0]

数据以样本数量呈现，百分比标注在括号内。检测仪：采用MmaxSure HPV HR14检测试剂盒的LAMP平台。(1) 置信区间通过Wald方法并经过连续性校正计算得出。(2) 置信区间通过Jeffreys-Perks方法计算得出。(3) 置信区间通过Clopper-Pearson方法计算得出。HPV指人乳头瘤病毒；PCR指聚合酶链反应。

与参考PCR检测法相比，LAMP检测法的总体一致性率为99.6%，933份样本中仅有4例结果不一致。所有不一致案例均为假阴性结果，未出现假阳性结果（表3）。

讨论

在本研究中，与实时PCR相比，LAMP检测法在14种受评估的高危HPV类型中的诊断准确率为99.5%。具体而言，对于HPV 16型和18型，其敏感度为97.8%，而对于其余类型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型），敏感度则达到100.0%。该检测法在所有检测类型中的特异性均为100.0%。当对所有高危HPV类型进行综合分析时，临床敏感度和特异性分别为99.4%和100.0%。共有4例假阴性结果（0.4%），其中包括2例经参考PCR检测为HPV16阳性的样本和2例HPV18阳性的样本。由于无法获取循环阈值值，因此无法确定这些不一致结果的成因。可能的原因是检测限附近的模板浓度过低以及引物结合区域存在序列变异。

HPV是性传播感染的主要致病因素，与超过95%的宫颈癌病例相关。12,13虽然细胞学检查在过去有助于将宫颈癌的发病率降低50%–85%，但其假阴性率约为20%–25%。流行病学数据显示，约60%的新发宫颈癌病例发生在未接受筛查的人群中，10%发生在管理不当的人群中，还有30%发生在因检测结果为假阴性而未能得到及时治疗的女性中——这通常是由于采样限制或解读错误所致。此外，细胞学检查在检测宫颈管内的腺体病变方面敏感性较低，从而导致腺癌的发病率上升，目前腺癌已占宫颈癌病例的20%–30%。这些局限性促使全球逐渐将高危HPV检测作为宫颈癌初级筛查的首选方法。14与细胞学检查相比，高危HPV检测具有显著更高的敏感度和阴性预测价值。随机临床试验表明，对于30岁以上的女性，高危HPV检测能提供60%–70%更高的预防侵袭性宫颈癌的保护效果。它尤其擅长检测腺体异常，还能将筛查间隔延长至5年。高危HPV检测法更为客观，观察者之间的差异较小，且适合在技术力量有限的条件下进行集中处理。此外，高危HPV检测还支持自我采样，其敏感性可与医生采集的样本相媲美，有助于提高未接受筛查人群的筛查覆盖率。14由于LAMP检测所需的仪器较少，且能快速给出可视化结果，因此也可能适用于自我采集的样本。不过，本研究仅评估了医生采集的宫颈样本，还需通过自我采集的样本进行进一步验证。

目前大多数HPV检测平台都基于PCR技术，依靠HPV DNA的扩增来检测。这类检测通常针对14种与宫颈癌及其他肛门生殖器癌症密切相关的高危HPV类型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型）进行检测。在经过验证的检测方法中，其临床敏感度和特异性通常处于相似水平。14尽管实时PCR技术在HPV检测方面具有较高的敏感度和特异性，但它也存在一些实际缺陷。该检测需要昂贵的仪器以及熟练的实验室人员来进行操作和结果解读，因此不太适合大规模人群筛查，尤其是在资源匮乏的地区。9此外，在基于PCR的病原体检测中，污染问题也一直较为突出。15,16常见的污染来源包括样本处理过程中产生的气溶胶，以及外来DNA意外混入PCR试剂中。而且，该检测的耗时通常超过2小时，因此不太适合那些需要快速出结果的应用场景。10迄今为止，LAMP检测尚未获得正式的监管批准，也没有得到广泛的临床验证。17不过，先前的研究已经揭示了其多项显著优势。18–22首先，LAMP检测在等温条件下进行，只需使用水浴或金属加热块等简易设备即可维持这种条件，因此非常适合在基础设施薄弱或电力供应不稳定的环境中使用。虽然也可以使用更先进的仪器，但对于HPV筛查所要求的定性检测来说并非必需。其次，LAMP检测的速度明显快于传统的PCR方法。整个反应时间通常在1小时以内，有些情况下甚至可在20分钟内得出结果。这样的快速出结果速度在临床环境中极具优势，能够实现及时诊断，减少患者的等待时间。第三，正如本研究和其他研究所示，LAMP检测具有较高的敏感度和特异性。第四，LAMP检测的成本通常低于基于PCR的方法，因此在资源匮乏的地区更易于推广应用。

尽管有这些优势，LAMP检测也存在一些局限性。23与PCR不同，LAMP不太适合多重检测，当需要同时识别多个目标时就会面临挑战。此外，该检测依赖视觉解读，这就有可能带来主观性以及观察者之间的差异。24,25在本研究中，由于颜色变化结果由单一评估者解读，因此无法评估观察者之间的一致性，这也是未来需要研究的方向。最后，尽管LAMP本质上是一种定性检测方法，但目前也有研究正在探索实现定量分析的方法。26,27尽管存在这些局限，LAMP检测已应用于多种传染病的诊断中，包括结核病和病毒感染，这体现了它作为一种多功能且易于使用的检测平台的潜力。28–34目前有多种LAMP检测方法，每种方法都有其独特的优势和局限性。本研究中使用的颜色变化检测法特别适合在基层医疗机构中使用，因为无需特殊设备即可通过视觉判断结果。与基于荧光的方法相比，它更具成本效益且速度更快。24,35此外，如在本研究中所做的那样，在扩增前向反应管中加入HNB染料，可避免反应后需要打开试管而带来的气溶胶污染风险。11不过，这种方法在定量方面存在困难，其敏感度和准确性可能低于基于荧光的检测系统。24基于浊度的检测方法在设计上最为简单，但由于在低拷贝数样本中视觉识别度较差，通常需要浊度计才能提高准确性。25此外，浊度读数可能会随时间发生变化，从而影响结果的重复性和可靠性。36基于荧光的检测方法具有更高的敏感度和定量能力，但成本较高，且由于依赖复杂的仪器设备，不太适合在野外环境中使用。24在以往利用LAMP检测高危HPV的研究中，人们采用了多种不同的检测策略。有一项研究使用了基于浊度的检测方法，分析了大量样本（n=1,188），但其方法与我们使用的颜色变化检测法有所不同。18另一项针对所有高危HPV类型的研究采用了基于荧光的检测方法，但样本量相对较小（n=50）。37还有一项研究使用颜色变化检测法检测23种HPV基因型，共分析了450份临床样本。38据我们所知，本研究是目前规模最大的临床样本研究，所有高危HPV类型都是通过颜色变化LAMP检测法检测出来的。39这是我们研究的显著优势，也为该方法的实际应用提供了更多证据。

消除宫颈癌已被视为全球公共卫生领域的重点任务，世界卫生组织在2018年制定的“90–70–90”目标便强调了这一点。39–41这些目标旨在到2030年实现：90%的女孩接种HPV疫苗，70%的女性接受高效宫颈癌筛查，以及90%的检测阳性者能够获得适当的治疗。世界卫生组织还强调，需要增加能够实施“一次就诊完成筛查和治疗”服务的机构的数量。为了实现这一目标，理想的筛查工具应符合世界卫生组织规定的目标产品标准，包括高敏感度、易用性、成本效益、便携性，以及适合在基层医疗机构进行检测。42在此背景下，我们研究中评估的颜色变化LAMP检测法满足了许多这些标准，有望成为资源匮乏地区检测HPV的有效工具。它的快速、低成本、操作简单以及较高的诊断准确度，使其有极大的潜力被纳入宫颈癌筛查项目，尤其是在服务不足的地区。综上所述，这些研究结果支持将颜色变化LAMP检测法作为一种实用工具，用于扩大宫颈癌筛查的范围。

结论

本研究表明，颜色变化LAMP检测法是一种快速、低成本且无需特殊设备的检测方法，尤其适合在资源匮乏的地区用于高危HPV筛查。尽管该检测法属于定性检测，且可能存在假阴性结果，但其与PCR检测的结果一致性很高，可作为初步的分流检测工具。