《Frontiers in Microbiology》：Cooperative antibiotic resistance in bacteria: beyond biofilms
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摘要：微生物之间的合作行为，如生物被膜（biofilm）形成，广泛存在，并通过促进遗传交换和环境适应性，在抗生素耐药性的出现和进化中发挥关键作用。细菌合作可涉及分泌代谢代价高昂的“公共物品”（public goods），从而使邻近细胞受益。这些公共物品包括β-
摘要：微生物之间的合作行为，如生物被膜（biofilm）形成，广泛存在，并通过促进遗传交换和环境适应性，在抗生素耐药性的出现和进化中发挥关键作用。细菌合作可涉及分泌代谢代价高昂的“公共物品”（public goods），从而使邻近细胞受益。这些公共物品包括β-内酰胺酶（β-lactamases）、氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase）、外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）、代谢产物及信号分子，它们可通过降低局部抗生素浓度来保护敏感细菌，从而减弱选择压力。重要的是，编码这些胞外产物的基因通常经历水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT），促进微生物群落内跨物种的合作性相互作用。在本综述中，研究人员总结了目前关于这些胞外产物的知识，强调了它们在合作性抗生素耐药性发展和进化中的作用，探讨了其对抗生素治疗的潜在意义，并指出了当前研究中的关键空白。研究人员还审视了未来的研究方向，并考虑了将微生物社会性相互作用和群落动态整合到抗菌策略中，可能为减少抗生素耐药性的出现和传播提供新途径。
细菌中的合作性抗生素耐药性（cooperative antibiotic resistance, CoopAR）是一种群落水平的现象，耐药菌产生多种公共物品，通过修饰局部环境或邻近细胞的生理状态，降低抗生素的有效影响，从而使敏感或低耐药细胞在原本抑制性抗生素浓度下得以存活或生长。本综述聚焦于不依赖生物被膜形成的CoopAR机制，系统阐述了介导CoopAR的主要公共物品类型及其作用机制。
1 引言
抗生素耐药性在全健康（One Health）框架下构成日益严重的全球性威胁，新抗生素开发缓慢加剧了这一挑战。传统观点将抗生素耐药性视为基因编码的细胞自主性状，但近期研究强调了合作性抗生素耐药性的重要性。CoopAR是一种群落水平现象，耐药菌产生的因子直接或间接作为公共物品发挥作用，通过修饰局部环境或邻近细胞生理状态，降低抗生素的有效影响，使敏感或低耐药细胞得以存活。实验和理论研究均证明，耐药菌可在抗生素胁迫下保护敏感邻居，通过抗生素耐受（tolerance）和持留（persistence）机制促进集体生存动态。CoopAR还引入独特的生态和进化动态，包括跨物种合作、非产生型“欺骗者”（cheaters）的利用以及表型异质性的出现。
方框1解释了抗生素耐药性/耐受性/持留性的区别：耐药性使细菌能在更高抗生素浓度下生长，通常通过最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）量化；耐受性不改变MIC，但延长杀灭细菌群体所需时间；持留性则不是遗传性的，与瞬时的生理状态相关。
生物被膜是研究CoopAR的重要生态框架，但CoopAR超越了生物被膜相关的生活方式。方框2指出，生物被膜的保护作用与CoopAR是重叠但非同义的概念。胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质本身是生物被膜特异的公共物品，而许多CoopAR机制，包括胞外β-内酰胺酶、抗生素修饰酶、胞外囊泡和可扩散代谢物，可以在生物被膜内外均发挥作用。
2 合作性抗生素耐药性的社会动力学
抗生素敏感细菌可在表达CoopAR因子的细胞附近持续存活。从进化角度看，这种合作性保护的维持可通过汉密尔顿合作理论解释，合作通过产生者的直接适合度收益或由遗传相关个体间包容适合度增加带来的间接适合度收益而进化。当合作性耐药决定因子发生水平转移时，这些收益可扩展到携带相同合作性耐药决定因子的邻近细胞。
然而，由于公共物品无论贡献如何均可被邻近细胞获取，合作性耐药容易受到非产生型“欺骗者”的利用。方框3阐述了公共物品和公地悲剧的概念：公共物品是代谢昂贵但群体成员可自由获取的分子或活动；公地悲剧是非合作者对公共物品的利用，最终由于欺骗的适合度优势导致合作的崩溃。
为对抗欺骗者的利用，亲缘选择被认为是维持细菌合作的重要机制。水平基因转移（HGT）可将非产生者转化为生产者，在功能水平上增加局部亲缘度并稳定合作。即使在所有细胞携带相同抗生素耐药基因的同源群体中，CoopAR的产生也可赋予群体水平优势，表达水平变异可能促进劳动分工，高表达细胞保护低表达细胞。
3 合作性抗生素耐药性的机制
3.1 胞外降解抗生素的CoopAR
胞外酶对抗生素的降解是CoopAR最重要的机制之一，β-内酰胺酶是最普遍且临床意义最显著的抗生素耐药酶。β-内酰胺酶水解β-内酰胺环，使β-内酰胺类抗生素失活。β-内酰胺酶产生菌可跨物种保护敏感细菌，增加β-内酰胺类抗生素治疗微生物感染的失败率。胞外β-内酰胺酶可灭活周围环境中的抗生素，从而保护邻近敏感菌。不同β-内酰胺酶可对一系列β-内酰胺底物提供交叉保护。部分β-内酰胺酶被包装在胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）中释放到环境，在环境中灭活抗生素。NDM-1通过脂质化锚定在膜上，进一步促进其掺入EVs并促进碳青霉烯酶活性的胞外传播。胞外β-内酰胺酶产生的生态后果已在液体培养基、固体琼脂培养基和生物被膜等多种环境中得到证明。
除β-内酰胺酶外，碱性蛋白酶Apr的胞外分泌可水解灭活多黏菌素，介导革兰阳性菌的多黏菌素耐药，作为CoopAR发挥作用。
3.2 胞内灭活抗生素的CoopAR
胞内抗生素修饰或降解酶可通过降低环境中活性抗生素浓度产生合作效应。最典型的例子是氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT），通过乙酰化灭活细胞质中的氯霉素。由于氯霉素与50S核糖体亚基的结合是可逆的，一旦胞外氯霉素浓度降至抑制水平以下，细菌生长可恢复。表达CatA1的氯霉素耐药菌通过胞内灭活氯霉素，保护敏感的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）群体。表达四环素灭活酶（Tet(X2)）或大环内酯灭活酶（Ere(A)）的细菌也可产生跨物种CoopAR，降低胞外培养基中活性抗生素浓度，使敏感细胞在浓度低于其MIC时恢复生长。
胞内介导的CoopAR依赖于抗生素对细菌细胞的高通透性和胞内降解酶的降解效率。氯霉素作为两亲性化合物，可扩散进入脂质双层并以较高频率穿透细菌细胞，因此可被胞内降解酶快速降解。由于β-内酰胺酶介导的灭活发生在胞外培养基中，直接使敏感伙伴受益，其CoopAR效率高于CatA1、Ere(A)和Tet(X2)。
3.3 通过隔离和中和抗生素的公共物品实现CoopAR
细菌还可通过释放隔离或中和抗生素的胞外因子实现耐药。在革兰阳性菌中，达托霉素耐药通常由释放膜磷脂或应激反应蛋白介导，这些分子可结合并灭活抗生素。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）释放磷脂作为诱饵隔离达托霉素，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）分泌LiaX结合抗菌肽并激活LiaFSR应激反应系统。胞外囊泡可吸收或降解抗生素，降低其在环境中的有效浓度。在金黄色葡萄球菌ΔagrA突变体中，Agr群体感应系统功能丧失导致突变体释放“诱饵”膜磷脂灭活达托霉素，其培养上清液可保护邻近野生型细胞，揭示了该机制的公共物品性质。
3.4 通过环境和生理变化实现CoopAR
不直接作为抗生素耐药因子的胞外代谢物和可扩散分子可作为促进CoopAR的公共物品。三甲胺通过改变环境pH和降低抗生素吸收，提高群体水平四环素耐药性；氨可降低抗生素通透性，增强对四环素和氨苄西林的耐药性。微生物挥发性化合物可作为长距离信号分子，直接调节邻近细胞生理状态，使CoopAR扩展到空间分离的细菌群体。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的2′氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone, 2-AA）通过调节细胞翻译促进多物种群落中的抗生素存活；大肠杆菌（Escherichia coli）释放的吲哚诱导邻近细菌外排泵表达。伯克霍尔德菌（Burkholderia ambifaria）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的挥发性有机化合物可增加邻近细菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类和四环素等多种抗生素类别的耐药性。气体递质如H
2S通过缓解抗生素诱导的氧化应激，增强细菌对多种抗生素的存活。
4 合作性抗生素耐药性与水平转移
水平基因转移（HGT）通过质粒接合、噬菌体介导的转导、自然转化和胞外囊泡介导，与CoopAR存在复杂但不可否认的关联。有研究甚至提出HGT本身可被视为一种公共物品。质粒是能够半自主复制的染色体外DNA元件，可通过接合介导CoopAR基因在群体和群落间的转移。编码β-内酰胺酶和氯霉素乙酰转移酶的CoopAR基因通常位于质粒上。质粒携带提供多种情境优势：增加基因拷贝数、帮助基因在不同细胞间穿梭、允许快速获得和丢失。接合质粒还可通过HGT将非产生型受体转化为产生者，促进合作的进化稳定性。反之，CoopAR可通过增加敏感受体细胞在抗生素胁迫下的存活来增强质粒介导的HGT，形成合作性耐药与HGT之间的正反馈循环。
质粒介导的HGT已被提出通过将非产生型受体转化为产生者来对抗欺骗，从而稳定合作性抗生素耐药。质粒的多拷贝性质和接合再传递可能减缓欺骗的选择。然而，近期比较基因组分析挑战了质粒普遍稳定合作的观点，质粒介导的HGT似乎更有效地促进合作基因的初始入侵和传播，而非长期维持。
细菌胞外囊泡（EVs）也可促进抗生素耐药性的水平转移。OMVs的显著优势是囊泡内的货物分子可在长距离安全运输而不被稀释和降解。大肠杆菌OMVs可促进包括抗生素耐药基因和毒力基因在内的遗传物质转移至受体细菌。有趣的是，β-内酰胺类抗生素治疗可增加EVs的分泌及其β-内酰胺酶含量。
5 合作性抗生素耐药性的转化挑战和临床意义
现有证据表明，CoopAR更可能发生在高细菌密度、长期细菌持续存在和多微生物群落的临床环境中。慢性气道感染（如囊性纤维化患者）、密集定植的肠道微生物群落和多微生物感染提供有利于CoopAR的生态条件。然而，体外充分混合系统中观察到的公共物品扩散是否可直接外推至感染组织仍不确定。感染组织表现出空间异质性和局部细菌群落，可能限制胞外产物的扩散并导致不均一的抗生素暴露。
β-内酰胺酶是临床重要的耐药决定因子，特别是在产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase, ESBL）的细菌中。实验研究表明，产生β-内酰胺酶的细菌可在体内降解β-内酰胺类抗生素，保护敏感细胞免于抗生素暴露并导致治疗失败。共生大肠杆菌产生的功能性β-内酰胺酶已被证明可降低氨苄西林治疗期间单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和艰难梭菌（Clostridioides difficile）等病原体的清除，同时促进其全身传播。
从临床角度看，优化抗生素药代动力学/药效学、确保感染部位充分的药物暴露、避免低于MIC的延长时期，可限制有利于合作性保护的环境条件。联合抗菌治疗和抗菌药物管理计划预计可减少促进合作性耐药出现和维持的选择压力。
6 讨论
综合现有证据表明，CoopAR在细菌耐药动态中起决定性作用，挑战了耐药表型的检测和解释，并促进了耐药决定因子的水平传播。CoopAR是有前景的治疗靶点，因为破坏细菌合作可在不施加强选择压力的情况下提高抗生素疗效。关键策略包括直接靶向公共物品、破坏群体水平协调、利用“欺骗者”以及借鉴社会进化理论 destabilize 合作行为。群体感应抑制剂、β-内酰胺酶抑制剂等抗合作策略为传统抗生素提供了有吸引力的补充。
CoopAR机制也可被治疗性利用以保护宿主微生物群。基于β-内酰胺酶的方法，包括口服酶制剂（如SYN-004）和表达β-内酰胺酶的工程益生菌菌株，已被成功用于降解肠道中残留的β-内酰胺类抗生素，从而保护肠道微生物群。
当前主要挑战不再是识别合作机制，而是将这些发现转化为临床相关治疗策略。大多数证据来自简化的实验系统，而临床感染是空间异质、宿主影响的、动态暴露于抗生素且经常是多微生物的。CoopAR是细菌群落的生态水平属性，而非局限于单个病原体的遗传性状，这一观点拓宽了抗生素耐药性的传统理解。
7 未来展望
确定CoopAR如何在临床相关感染环境中运作是首要任务。结合空间代谢组学、先进成像和微流控感染模型，可实现感染组织中公共物品、信号分子和抗生素的空间定位。单细胞转录组学可区分批量分析中被掩盖的产生者和受益者亚群，合成微生物群落为解析种间合作和代谢相互作用提供可控平台。将多组学数据集与系统生物学和人工智能（artificial intelligence, AI）整合，可促进合作性耐药网络的预测和关键公共物品产生者的识别。这些多学科方法将提供对CoopAR更全面的理解，促进生态学见解向临床相关策略的转化，以对抗抗菌药物耐药性。
