肯普氏丽龟（Lepidochelys kempii）巢穴相关微生物群落支持Rancho Nuevo保护区保护管理

《Frontiers in Ecology and Evolution》：Nest-associated microbial communities of the Kemp’s Ridley Sea Turtle (Lepidochelys kempii) support conservation management at Rancho Nuevo sanctuary

　　

摘要
引言：极度濒危物种筑巢栖息地中的微生物群落尽管可能影响胚胎发育和孵化成功率，但仍未得到充分研究。方法：研究人员利用高通量16S rRNA扩增子测序技术，对墨西哥Rancho Nuevo保护区肯普氏丽龟（Lepidochelys kempii）巢沙中的细菌群落进行了表征。研究人员分析了来自自然巢穴、人工围栏和海滩对照的25份样本，对其组成、多样性、网络和功能进行了评估。结果：γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）在大多数样本中占优势，但其相对丰度因地点而异。在科水平上，产碱菌科（Alcaligenaceae）最为丰富，而溶杆菌科（Lysobacteriaceae）在中央围栏和Calabazas海滩样本中共同占优势。α多样性在不同地点间（Kruskal-Wallis检验，p > 0.05）或不同巢穴类型间（Mann-Whitney U检验，p > 0.05）均无显著差异。β多样性显示显著的地点水平结构（PERMANOVA：伪F = 1.338，R2 = 0.355，p = 0.002），但检测到显著的离散度异质性。自然巢穴与人工巢穴之间未发现差异（PERMANOVA：伪F = 1.181，R2 = 0.049，p = 0.170）。LEfSe分析、指示物种分析和PICRUSt2功能预测均未鉴定出与任一巢穴类型显著相关的分类群或代谢通路。溶杆菌科（Lysobacteriaceae）在两种巢穴类型中均被检测到，而潜在病原体（如弧菌属Vibrio spp.）的相对丰度较低。然而，仅凭16S数据无法推断功能意义。讨论：在研究人员数据集的局限性内（样本量小、单时间点），巢穴搬迁不会导致微生物多样性、组成、网络或预测功能的统计学可检测变化。这些结果是初步的，并不证明绝对的微生物安全性。它们支持在Rancho Nuevo继续使用人工围栏，且根据当前数据未发现明显的微生物学后果。研究人员建议对地点特异性变异进行靶向监测，并在未来整合功能宏基因组学。

肯普氏丽龟巢穴微生物群落支持Rancho Nuevo保护区保护管理：一项整合生态学解读

**研究背景与意义**

微生物群落在生态系统功能中扮演基础性角色，参与养分循环、有机质分解和环境稳定性维持。在海陆交汇的沿海沉积环境中，沉积物相关微生物群落在动态理化条件下介导生物地球化学过程，对生态系统健康至关重要。海龟筑巢海滩形成了独特的微生境，陆地和海洋驱动因素在此交汇，支持复杂且功能多样的微生物集合。从保护角度看，理解这些微生物群落至关重要，因为它们直接与发育中的胚胎相互作用，可能影响孵化成功率。然而，常见的保护管理实践——如巢穴搬迁——对微生物群落的影响仍鲜有记录。已有研究提出微生物群落影响胚胎发育的多种机制，包括有益微生物对病原体的竞争性排斥、抗菌化合物的产生、通过代谢活动改变巢穴理化环境，以及机会性或毒力细菌对卵或幼体的直接致病效应。

肯普氏丽龟（Lepidochelys kempii）是世界上最濒危的海龟物种之一，其主要筑巢地集中在墨西哥湾西部，尤其是墨西哥塔毛利帕斯州的Rancho Nuevo。长期保护项目包括将巢穴搬迁至人工围栏，以减轻捕食、洪水和人类干扰。尽管搬迁增加了幼体产出，但其对巢穴相关微生物群落的潜在影响尚未得到充分记录。此前对地中海蠵龟（Caretta caretta）和绿海龟（Chelonia mydas）的研究表明，巢穴微生物群落具有多样性、物种间和地点间变异性，并可能对繁殖成功产生重要影响。然而，对自然巢穴与搬迁巢穴之间同时进行分类组成、α和β多样性以及系统发育结构比较的研究仍然稀缺，限制了对巢穴搬迁生态后果的普遍性认识。

**研究目标与主要发现**

本研究在Rancho Nuevo海龟保护区，利用高通量16S rRNA扩增子测序技术，在综合生态框架内调查了与肯普氏丽龟巢穴相关沙中的细菌多样性和群落结构。研究人员比较了不同筑巢地点、巢穴深度和巢穴类型（自然原位巢穴与人工围栏）之间的群落组成，并纳入了海滩对照样本以建立周围环境的基线微生物多样性。除分类学分析外，还评估了功能相关类群的相对丰度，包括已知包含潜在病原体的属（如弧菌属Vibrio spp.）和与拮抗功能相关的类群（如溶杆菌科Lysobacteriaceae），以推断巢穴管理的潜在生态风险和益处。研究人员进行了LEfSe分析、共现网络分析、指示物种分析和PICRUSt2功能预测。研究假设巢穴搬迁不会导致统计学可检测的微生物群落变化。

研究结果表明，在类水平上，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）在大多数样本中占优势，但其相对丰度在地点间差异显著。南围栏样本几乎完全由γ-变形菌纲组成（约75-100%），而原位标记+6.3和+6.9的样本中，杆菌纲（Bacilli）和拟杆菌纲（Bacteroidia）的比例达到或超过γ-变形菌纲。在科水平上，产碱菌科（Alcaligenaceae）总体最丰富，但在南围栏样本中几乎独占，而在中央围栏和Calabazas海滩样本中与溶杆菌科共同占优势。α多样性分析显示，不同采样地点（Kruskal-Wallis检验，p > 0.05）或不同巢穴类型（Mann-Whitney U检验，p > 0.05）之间均无显著差异，效应量较小（|r| < 0.13）。β多样性分析显示显著的地点水平结构（PERMANOVA：伪F = 1.338，R2 = 0.355，p = 0.002），但检测到显著的组内离散度异质性（betadisper：F = 9.698，p = 0.002）。自然巢穴与人工巢穴之间无显著差异（PERMANOVA：伪F = 1.181，R2 = 0.049，p = 0.170；ANOSIM：R = 0.041，p = 0.187）。LEfSe分析未发现显著富集的分类群，共现网络分析显示相似拓扑性质，指示物种分析未鉴定出显著指示类群，PICRUSt2功能预测未显示显著差异。

**主要技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：基于Illumina MiniSeq平台的16S rRNA扩增子测序（引物27F/1492R，2×300 bp双端测序）；使用DADA2流程进行序列处理和质量控制，获得扩增子序列变体（ASV）；基于SILVA数据库（版本138.2）进行分类学分配；使用phyloseq包构建和分析微生物组数据对象；采用vegan包进行多元统计分析（PERMANOVA、ANOSIM、离散度检验）；使用MicrobiomeMarker包进行LEfSe分析；使用indicspecies包进行指示物种分析；使用igraph包构建共现网络；使用PICRUSt2进行功能预测；使用MUSCLE和FastTree构建系统发育树。样本采集自Rancho Nuevo保护区，包括自然巢穴（9份）、人工围栏（11份）和海滩对照（5份），共25份样本，采样深度分为表层（0-10 cm）、中层（20-40 cm）和底层（40-70 cm）。样本采集获得DGVS许可（SBRA/DGVS/05097/25），序列数据提交至SRA（BioProject：PRJNA1463276）。

**研究结果详情**

**3.1 相对细菌组成**：在类水平上，γ-变形菌纲在大多数样本中占优势，但南围栏样本最为均一（约75-100%），而原位+6.3和+6.9样本中杆菌纲和拟杆菌纲比例显著升高。在科水平，产碱菌科总体最丰富，但在中央围栏和Calabazas海滩样本中与溶杆菌科共同占优势（溶杆菌科约25-40%）。盐单胞菌科（Halomonadaceae）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）在多个地点持续检出，鞘脂杆菌科（Sphingobacteriaceae）在Calabazas海滩和若干原位样本中显著存在。属水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和产碱菌属（Alcaligenes）最为丰富，但无属与特定巢穴类型专一关联。

**3.2 α多样性分析**：Kruskal-Wallis检验显示不同采样地点间无显著差异（Observed: H = 11.21, p = 0.130; Shannon: H = 11.06, p = 0.136; Simpson: H = 10.07, p = 0.185）。Mann-Whitney U检验显示自然巢穴与人工巢穴间无显著差异（Observed: U = 66, p = 0.572; Shannon: U = 71, p = 0.767; Simpson: U = 89, p = 0.536），效应量较小（|r| < 0.13）。人工巢穴的ASV丰富度分布范围更广，但中位数与自然巢穴相当。

**3.3 采样地点间β多样性与群落相似性**：基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA检测到显著的地点水平差异（伪F = 1.338，R2 = 0.355，p = 0.002），但betadisper显示显著的离散度异质性（F = 9.698，p = 0.002），ANOSIM证实地点水平结构（R = 0.340，p = 0.003）。排序图显示两个部分重叠的簇，大致对应海滩北段与中-南段。海滩对照样本未形成独立簇，而是与自然和人工巢穴样本重叠。

**3.4 自然巢穴与人工巢穴的β多样性比较**：PERMANOVA未发现显著差异（伪F = 1.181，R2 = 0.049，p = 0.170），betadisper确认离散度同质性（F = 0.117，p = 0.726），ANOSIM结果一致（R = 0.041，p = 0.187）。自然巢穴的置信椭圆更大，表明其内部组成变异性高于人工巢穴。

**3.5 差异丰度、共现网络和指示物种分析**：LEfSe分析未发现显著差异丰度分类群；共现网络分析显示自然巢穴（127个节点，312条边）和人工巢穴（118个节点，286条边）具有相似的拓扑性质（密度、模块度、平均度）；指示物种分析未鉴定出显著指示类群。

**3.6 功能预测分析（PICRUSt2）**：554条MetaCyc通路均无显著差异（FDR > 0.05），最丰富的通路涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢和膜转运，两种巢穴类型间相对丰度相似。

**3.7 系统发育结构与生态分布**：50个最丰富属的系统发育树显示，几乎所有末端分支都同时出现多种采样地点和两种巢穴类型的符号，表明细菌谱系在各地点和巢穴类型间广泛共享，不存在系统发育聚类。

**讨论与结论**

研究结果表明，在数据集局限性内（样本量小、单时间点），巢穴搬迁不会导致微生物多样性、群落组成、网络组织或预测功能的统计学可检测变化。地点水平显著的β多样性结构以及组内离散度异质性强调了局部环境梯度的重要性。溶杆菌科的存在和潜在病原体（如弧菌属）的低相对丰度在两种巢穴类型中均一致，提示原生微生物群落可能限制病原体建立，但仅凭16S数据无法确认抗菌活性或绝对病原体负荷。研究强调，无显著差异并不等同于微生物学安全性或等价性。未来研究需增加重复、环境参数测量、功能宏基因组学和纵向采样，以更全面地解析巢穴微生物群的生态和保护意义。总体而言，基于当前数据，人工围栏在Rancho Nuevo保护区保护肯普氏丽龟巢穴方面似乎是微生物学上良性的保护工具。