《Frontiers in Veterinary Science》：Development of a dual fluorescent microsphere—based lateral flow immunoassays for simultaneous detection of Brucella and Mycobacterium bovis antibodies
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引言：牛布鲁氏菌病和牛结核病是重要的人畜共患病，对人类和动物健康构成严重威胁，并给畜牧业造成重大经济损失。因此，迫切需要一种适用于两种疾病现场同时检测的快速诊断方法。方法：研究人员制备了与重组链球菌蛋白G（rSPG）偶联的荧光微球，并将其用作示踪物。将布鲁氏菌
引言：牛布鲁氏菌病和牛结核病是重要的人畜共患病，对人类和动物健康构成严重威胁，并给畜牧业造成重大经济损失。因此，迫切需要一种适用于两种疾病现场同时检测的快速诊断方法。方法：研究人员制备了与重组链球菌蛋白G（rSPG）偶联的荧光微球，并将其用作示踪物。将布鲁氏菌脂多糖（LPS）和牛分枝杆菌MPB70蛋白分别包被于检测线1（TL1）和检测线2（TL2），而将rSPG包被于质控线（CL）。该配置使得能够开发一种用于同时检测布鲁氏菌（Brucella spp.）和牛分枝杆菌（M. bovis）抗体的双抗体快速检测试纸条。系统评估了该试纸条的最佳反应条件和性能特征。结果与讨论：双快速检测试纸条可在20分钟内完成检测。最佳包被浓度确定为：布鲁氏菌检测线（TL1）0.5 mg/mL，牛分枝杆菌检测线（TL2）1.0 mg/mL，荧光微球的最佳偶联浓度为0.25 mg/mL。使用荧光读取仪，以检测线荧光强度与质控线荧光强度之比（T/C）表示的最低检测阈值，对于布鲁氏菌为0.04109，对于牛分枝杆菌为0.0276。双检测试纸条显示出高特异性，无可检测到的交叉反应性，灵敏度高于商业胶体金检测试纸条，并且具有优异的批内和批间重复性（变异系数<10%）。对67份临床样本的初步测试表明，该双检测试纸条与商业ELISA抗体检测试剂盒在牛布鲁氏菌病和牛结核病检测中的符合率分别为92.54%和95.52%。成功开发了一种基于荧光微球的双抗体快速检测试纸条，用于同时检测布鲁氏菌（Brucella spp.）和牛分枝杆菌（M. bovis）抗体。该试纸条具有高灵敏度和高特异性，是快速诊断牛布鲁氏菌病和牛结核病抗体的高度适用工具。
牛布鲁氏菌病和牛结核病是由布鲁氏菌（Brucella spp.）和牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的重要人畜共患病，对畜牧业和公共卫生构成严重威胁。现有诊断方法如细菌培养、PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）等存在耗时长、需专业设备、成本高或灵敏度不足等问题，难以满足现场快速筛查需求。为克服这些局限，研究人员在《Frontiers in Veterinary Science》发表论文，开发了一种基于双荧光微球的侧向层析免疫分析试纸条，用于同时检测布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗体。该研究旨在提供一种简便、快速、灵敏的现场诊断工具，支持牛布鲁氏菌病和牛结核病的监控与清除计划。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：制备荧光微球与重组链球菌蛋白G（rSPG）的偶联物作为示踪物；将布鲁氏菌脂多糖（LPS）和牛分枝杆菌重组MPB70蛋白（rMPB70）分别包被于检测线1（TL1）和检测线2（TL2），rSPG包被于质控线（CL），组装成双检测试纸条；使用荧光读取仪定量检测荧光信号并计算T/C比值；优化包被浓度和偶联浓度；通过检测阴性血清样本确定截断值（cutoff value）；并利用来自中国宁夏、河北、吉林等省份的奶牛血清样本（经商业ELISA筛选）进行性能验证。
研究结果如下：
**3.1 试纸条的组装**：成功构建了荧光微球免疫层析试纸条，检测线1（TL1）包被布鲁氏菌LPS，检测线2（TL2）包被牛分枝杆菌rMPB70，质控线（CL）包被rSPG。在365 nm紫外灯下可观察到荧光条带，实现可视化结果判读。
**3.2 不同抗原包被浓度的检测结果**：通过比较不同浓度LPS和rMPB70的荧光强度，确定最佳包被浓度为：TL1（LPS）0.5 mg/mL，TL2（rMPB70）1.0 mg/mL。当LPS浓度降至0.25 mg/mL时无荧光条带，而rMPB70在0.25 mg/mL时仍有弱带。
**3.3 不同rSPG蛋白偶联浓度的检测结果**：将不同浓度rSPG与荧光微球偶联，荧光分析显示0.25 mg/mL rSPG偶联时荧光强度最高（115,000），显著高于0.125 mg/mL和0.5 mg/mL，因此选定0.25 mg/mL为最佳偶联浓度。
**3.4 试纸条截断值的确定**：检测25份布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗体阴性血清，计算T/C比值。布鲁氏菌的截断值为0.04109（均值+3倍标准差），牛分枝杆菌的截断值为0.02768。
**3.5 分析灵敏度**：将阳性血清梯度稀释后，分别用本试纸条和商业胶体金试纸条检测。本试纸条在1:800稀释时仍可检出阳性（T/C值：布鲁氏菌4.379，牛分枝杆菌0.637），而商业胶体金试纸条在1:800时已无可见条带，表明本方法灵敏度更高。
**3.6 分析特异性**：检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、副结核分枝杆菌、牛致病性大肠杆菌和牛疱疹病毒1型（BoHV-1）抗体阳性血清，均无交叉反应，仅布鲁氏菌和牛分枝杆菌阳性血清出现荧光条带，证明特异性高。
**3.7 试纸条重复性**：使用4份双阳性血清进行批内和批间重复性测试。布鲁氏菌批内变异系数（CV）为5.2%~7.5%，批间CV为7.3%~9.2%；牛分枝杆菌批内CV为5.1%~7.8%，批间CV为7.9%~9.4%，均低于10%，重复性良好。
**3.8 试纸条符合率分析**：随机收集67份临床血清样本，以商业ELISA试剂盒为参考，本试纸条对布鲁氏菌的阳性符合率（PPA）为86.36%，阴性符合率（NPA）为95.56%，总符合率（OPA）为92.54%，Cohen's κ系数为0.83（几乎完全一致）；对牛分枝杆菌的PPA为80.00%，NPA为96.77%，OPA为95.52%，κ系数为0.70（高度一致）。
讨论部分总结：本研究开发的荧光微球双抗体试纸条可在15分钟内完成检测，同时筛查布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗体，相比传统方法缩短了时间和成本，提高了筛查效率。与商业胶体金试纸条相比，灵敏度更高，且批间稳定性更好。在非免疫地区，该试纸条对布鲁氏菌病筛查具有广阔应用前景，对牛结核病常规监测尤为重要。研究局限性包括：用于验证的阳性样本数量有限，尤其是牛分枝杆菌阳性样本；仅与一种商业产品比较，代表性不足。未来需扩大样本量并进行更多系统比较。
研究结论翻译：总之，研究人员成功建立了一种基于荧光微球的双抗体快速检测方法，用于同时检测布鲁氏菌（Brucella spp.）和牛分枝杆菌（M. bovis）抗体。该方法具有高灵敏度和高特异性，降低了检测成本，提高了检测效率。这些结果表明，该试纸条可作为现场和基层单位快速筛查牛布鲁氏菌病和牛结核病的实用工具。
