《Frontiers in Oral Health》：Delayed shifts in salivary microbiota composition following long-term use of 0.06% chlorhexidine toothpaste
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摘要
背景：氯己定是牙周治疗中的标准抗菌剂，然而其对共生口腔微生物组的长期影响及抗菌药物耐药性的作用仍不明确。目的：本研究评估了0.06%氯己定牙膏对健康个体唾液微生物组的生态学效应，重点关注分类组成、功能转变及预测的抗菌药物耐药性通路的发生率。方法：本研究设
摘要
背景：氯己定是牙周治疗中的标准抗菌剂，然而其对共生口腔微生物组的长期影响及抗菌药物耐药性的作用仍不明确。目的：本研究评估了0.06%氯己定牙膏对健康个体唾液微生物组的生态学效应，重点关注分类组成、功能转变及预测的抗菌药物耐药性通路的发生率。方法：本研究设计为一项前瞻性、单臂干预性试验，旨在评估口腔微生物组的时间动态变化。研究人员在三个特定时间点采集了11名健康参与者的唾液样本：基线期（使用参考含氟牙膏经过4周导入期后）、干预期（使用0.06%二葡萄糖酸氯己定牙膏12周后）以及洗脱期（随后使用参考含氟牙膏12周后）。测序靶向16S rRNA V3–V4区域。结果：在整个研究期间，α多样性保持稳定。然而，β多样性分析揭示了群落结构的显著转变，其中干预期与洗脱期之间的差异最为显著。研究人员鉴定了41条差异丰度代谢通路，包括在洗脱期间预测的β-内酰胺耐药通路的显著下调。虽然氯己定未增加预测的耐药相关通路，但在12周洗脱期结束时观察到向革兰氏阴性菌群的延迟性组成转变。结论：这些发现表明，0.06%氯己定并非生态学中性，牙科专业人员应仔细考虑氯己定长期使用的适宜性。临床试验注册：ClinicalTrials.gov，NCT07570927。
**论文解读：低浓度氯己定牙膏长期使用对唾液微生物组的生态学影响——一项前瞻性纵向干预研究**
**一、研究背景与科学问题**
口腔微生态的平衡对于口腔健康至关重要。稳定的口腔微生物群落是黏膜防御和稳态维持的基础，而菌群失调则与龋病和牙周炎等常见口腔疾病的发生发展密切相关。口腔卫生习惯及所使用的化学制剂是影响这一生态系统的重要外部因素。抗菌剂被广泛添加于牙科产品中以抑制口腔病原体，但其作用是否具有选择性，抑或会不加区分地削减有益共生菌群，是亟需阐明的问题。
氯己定是临床牙科中应用最广泛的广谱抗菌剂。市面上含氯己定的牙科产品浓度各异，涵盖漱口水、牙膏和凝胶等多种剂型。高浓度（如0.2%、0.12%）制剂被推荐短期使用，通常不超过28天；而低浓度制剂（如0.06%）则被临床支持用于长达6个月的干预，甚至被推向市场供长期使用而无明确时限。氯己定通过破坏细菌细胞膜发挥抗菌作用，对革兰氏阳性菌通常具有更强的效力，这归因于其表面更高的负电荷密度，有利于与阳离子抗菌剂结合。相比之下，革兰氏阴性菌因细胞外膜结构的复杂性，对该抗菌剂的渗透具有更强的屏障作用。这种差异敏感性提示，长期使用氯己定可能通过改变物种的相对比例而诱导生态失调，进而有利于耐药菌株的存活或破坏共生菌群的多样性。
抗菌药物耐药性已成为全球性的重大公共卫生挑战。已有体外研究表明，氯己定暴露可能与临床相关抗生素的交叉耐药性发展存在关联。然而，这些证据主要来源于采用亚致死浓度氯己定的体外模型，与临床实际应用条件存在差异。迄今为止，缺乏在商业牙科产品和标准使用方案背景下探究该关系的体内研究。因此，在健康人群中开展纵向研究，明确氯己定对唾液微生物组组成和功能潜力的影响，以及其对预测的抗菌药物耐药性标志物发生率的作用，对于指导安全有效的临床应用至关重要。
**二、研究设计与方法学概述**
该研究为一项单臂、前瞻性、纵向干预性试验，在捷克共和国布尔诺市当地社区招募了11名年轻、不吸烟、全身健康的成年参与者。纳入标准极为严格，要求无用药史、近6个月内无抗生素治疗、无未治疗的龋齿或炎症性牙周疾病，且基线口腔卫生状况优良。研究包含三个阶段：4周导入期使用标准非药物含氟牙膏建立微生物基线；12周干预期更换为含0.06%二葡萄糖酸氯己定的试验牙膏每日使用两次；随后12周洗脱期恢复使用参考含氟牙膏以评估微生物变化的可逆性。每个阶段结束时采集刺激性全唾液样本，采用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取总细菌DNA，针对16S rRNA V3–V4高变区进行扩增，并在Illumina MiSeq平台进行双端测序。生物信息学分析采用DADA2流程生成扩增子序列变异，基于SILVA参考数据库进行物种注释。α多样性以Shannon和Simpson指数评估，β多样性采用基于中心对数比归一化的Aitchison距离和总和标度归一化的Bray–Curtis相异度，通过置换多元方差分析检验组间差异。差异丰度分析采用DESeq2和edgeR双重方法取交集。功能预测采用PICRUSt2，多重检验校正使用Benjamini–Hochberg方法。
**三、主要研究结果**
**微生物多样性分析：** α多样性分析显示，各研究阶段间物种丰富度和均匀度无统计学显著差异，表明氯己定干预未导致物种数量的整体减少。然而，β多样性分析揭示了唾液微生物群落结构的显著时间性转变。两种相异度指标均显示整体群落差异显著，成对比较证实该转变主要由干预期与洗脱期之间的显著差异驱动，提示氯己定暴露后的群落重组在洗脱期才充分显现。
**分类组成与差异丰度：** 门水平分析显示，厚壁菌门在整个研究期间保持优势地位。与基线相比，洗脱期变形菌门和弯曲杆菌门的相对丰度显著增加，而放线菌门显著降低。科水平上，巴斯德氏菌科和弯曲杆菌科在洗脱期显著富集。属水平分析采用EdgeR和DESeq2两种统计模型的交集以确保稳健性，确认洗脱期的转变主要由嗜血杆菌属、聚集杆菌属、放线杆菌属和弯曲杆菌属的显著富集驱动，而Solobacterium和Atopobium的丰度则较基线显著降低。种水平上，未分类的嗜血杆菌种在洗脱期显著增加。值得注意的是，主要链球菌群在整个研究期间保持高度稳定。
**功能代谢通路与耐药预测：** PICRUSt2功能预测结合线性差异丰度分析显示，干预期与洗脱期之间共有41条代谢通路的丰度存在显著差异。洗脱期富集的通路主要涉及细胞膜组分和必需辅因子的生物合成，包括脂肪酸生物合成起始超通路、饱和脂肪酸延伸通路、生物素生物合成通路I，以及脂多糖生物合成相关通路如(Kdo)?-脂质A生物合成超通路和ADP-L-甘油-β-D-甘露庚糖生物合成通路。这些功能变化与革兰氏阴性变形菌门丰度增加的功能证据高度一致。在310条预测代谢通路中，针对与耐药机制相关的通路进行定向分析，发现与β-内酰胺耐药相关的肽聚糖生物合成通路PWY-6470和PWY-6471在洗脱期较氯己定干预期显著下调。纵向标准化丰度轨迹显示，这两条通路在干预期呈现非显著上调，停药后急剧下降，其动态变化与Atopobiaceae科丰度的波动相对应。
**四、讨论与结论**
本研究对氯己定暴露后唾液微生物组的长期动态进行了监测，特别是洗脱期的观察提供了独特的视角。研究结果显示，0.06%低浓度氯己定牙膏的长期使用并非生态学中性。虽然α多样性和临床牙科指数保持稳定，但群落结构在洗脱期发生了显著的组成性转变，以革兰氏阴性菌的富集为特征。这种延迟性转变提示，低浓度氯己定在活性干预阶段可能对唾液微生物组产生整体抑制效应，而非选择性消除特定类群；抑或该效应需要更长时间才能显现。在洗脱期观察到的变形菌门扩张，特别是巴斯德氏菌科成员的同步增殖，可能反映了群落对氯己定暴露解除后的适应性重组。尽管这些变化在统计学上显著，但鉴于α多样性和临床指标的稳定，其可能代表一种组成性适应而非临床意义上的菌群失调。
关于耐药性，研究结果提供了重要信息：长期暴露于0.06%氯己定并未增加预测的抗菌药物耐药性通路的流行率。与β-内酰胺耐药相关的肽聚糖生物合成通路在氯己定干预后仅出现非显著上调，随后在洗脱期显著下降。这与已有研究一致，即氯己定暴露后在体内未观察到耐药基因的显著变化。然而，由于本研究依赖16S rRNA基因测序，缺乏全基因组鸟枪法测序的物种级分辨率和功能基因直接检测能力，且基于相对丰度分析未包含绝对定量，这些局限性需要在解释结果时予以考虑。
临床意义方面，牙科专业人员在推荐氯己定产品时，应仔细权衡治疗获益与诱导延迟性微生物组转变的风险。本研究的结论明确指出，即使在低浓度下，氯己定对口腔微生物组的生态学影响也非中性，其长期使用的适宜性需要重新审视。未来研究应扩展至牙周炎患者、老年人群和吸烟者等高风险群体，以评估这些发现是否具有普遍性。
