《Frontiers in Immunology》：Intratumoral heterogeneity as a potential biomarker for immunotherapy response and postoperative recurrence in NSCLC
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背景：瘤内异质性（Intratumoral heterogeneity, ITH）与多种实体瘤的不良预后相关。然而，其在晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中作为免疫治疗预测性生物标志物的应用仍缺乏。方法：研究
背景：瘤内异质性（Intratumoral heterogeneity, ITH）与多种实体瘤的不良预后相关。然而，其在晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中作为免疫治疗预测性生物标志物的应用仍缺乏。方法：研究人员使用Maftools分析来自独立队列（POPLAR、OAK、Hellmann2018）的NSCLC体细胞变异，包括504例晚期NSCLC患者。此外，纳入121例接受根治性治疗并进行了733基因panel NGS检测手术样本的NSCLC患者（内部队列）。研究人员使用Shannon熵测量ITH，分析其与免疫原性标志物的相关性，并探索ITH对免疫治疗的预后影响及其在预测术后复发风险中的作用。利用TCGA队列，研究人员比较了低ITH（ITH-L）和高ITH（ITH-H）组之间的遗传特征，评估突变谱，并评价ITH评分与免疫细胞群之间的关联。结果：在Hellmann2018队列中，ITH-L与更高的持久临床获益（durable clinical benefit, DCB）率、客观缓解率（objective response rate, ORR）和中位无进展生存期（median progression-free survival, mPFS）相关，强调ITH-L可能是免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）治疗的潜在阳性预测因子。将ITH与肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）结合显示，ITH-L/TMB-H患者的DCB、ORR和mPFS显著更好，支持ITH与TMB联合评估时的潜在预测价值。在POPLAR/OAK队列中的验证支持ITH单独或联合TMB与免疫治疗结局的关联。ITH-L患者表现出更高的DCB、ORR、更长的mPFS和中位总生存期（median overall survival, mOS）。将ITH与循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）结合验证了这些发现。在早期手术NSCLC患者中，ITH-L与显著更高的中位无复发生存期（median recurrence-free survival, mRFS）相关。机制上，ITH-L组显示出更高的TMB、新抗原（SNV）和亚克隆基因组分数，同时降低的同源重组缺陷（homologous recombination deficiency, HRD）评分和拷贝数变异（copy number variation, CNV）负荷。突变分析确定XIRP2是最常改变的基因，在ITH-L组中富集，而SHOX2是唯一在ITH-H组中频率更高的基因。免疫浸润分析显示两组间M1巨噬细胞、活化记忆CD4+ T细胞和初始CD4+ T细胞存在显著差异。结论：ITH可能作为与晚期NSCLC免疫治疗结局和早期手术患者术后复发风险相关的潜在生物标志物。
**论文解读：瘤内异质性在非小细胞肺癌免疫治疗及术后复发中的预测价值**
**研究背景与问题**
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的85%，多数患者确诊时已为晚期，尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）如抗PD-1/PD-L1抗体显著改善了治疗格局，但临床反应高度异质，亟需可靠预测标志物。肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）虽被广泛研究，但单独预测效力有限。瘤内异质性（intratumoral heterogeneity，ITH）指同一肿瘤内不同亚克隆的遗传多样性，与多种实体瘤的不良预后相关，但其作为免疫治疗预测标志物在NSCLC中仍缺乏系统验证。此外，早期NSCLC术后复发率高，ITH对复发风险的影响尚不明确。本研究旨在阐明ITH单独及联合TMB对晚期NSCLC免疫治疗疗效的预测价值，并评估ITH对早期手术患者术后复发的作用。
**研究内容与结论**
研究人员整合了来自三个独立队列（POPLAR、OAK、Hellmann2018）共504例晚期NSCLC患者的数据，以及南方医科大学南方医院121例接受R0根治性切除并接受733基因panel NGS检测的早期NSCLC患者（内部队列），利用Shannon熵量化ITH，分析其与免疫治疗结局（客观缓解率ORR、持久临床获益DCB、无进展生存期PFS、总生存期OS）及术后复发风险（无复发生存期RFS）的关联，并通过TCGA队列比较高低ITH组间的基因组特征和免疫细胞浸润差异。主要结论：ITH-L（低ITH）与更好的免疫治疗疗效及更低的术后复发风险显著相关，且与TMB联合可进一步提升预测效能，机制上ITH-L组呈现更高的TMB、新抗原负荷和亚克隆分数，以及更低的HRD评分和CNV负荷，并伴有免疫细胞浸润增强。
**主要技术方法**
研究人员使用Maftools分析来自POPLAR、OAK和Hellmann2018队列（共504例晚期NSCLC）的体细胞变异数据，其中POPLAR/OAK队列采用Foundation One panel（315基因）进行ctDNA测序，Hellmann2018队列采用全外显子测序。内部队列（121例早期NSCLC手术患者，南方医科大学南方医院）使用733基因panel进行组织NGS测序。ITH通过Shannon熵基于等位基因频率分布计算，以中位值划分高低组。免疫治疗疗效评估基于接受ICI单药治疗的患者，术后复发分析基于多变量Cox回归。基因组特征和免疫细胞浸润分析基于TCGA-LUAD队列，免疫细胞比例通过CIBERSORT算法估算。
**研究结果**
**3.1 ITH alone can predict the efficacy of immunotherapy in Hellmann2018 cohort**
在Hellmann2018队列中，ITH-L组（低ITH）相比ITH-H组（高ITH）具有显著更高的ORR（52% vs 23%，P=0.026）、DCB（65% vs 42%，P=0.014）和更长的中位PFS（22.14 vs 5.42个月，HR=1.9，P=0.039），表明ITH-L是ICI治疗的潜在阳性预测因子。
**3.2 ITH combined with TMB can predict the efficacy of immunotherapy in Hellmann2018 cohort**
ITH-L组TMB显著高于ITH-H组（P=0.011）。在TMB-H亚组中，ITH-L患者ORR（73% vs 39%，P<0.001）、DCB（87% vs 52%，P=0.005）和PFS（未达到 vs 6.8个月，P=0.0017）均显著优于ITH-H患者，而TMB-L亚组内无显著差异。联合分析显示，ITH-L/TMB-H亚组获益最大，支持ITH与TMB联合的预测价值。
**3.3 Validation in the POPLAR/OAK cohorts**
在POPLAR/OAK队列中，ITH-L组相比ITH-H组具有更高的DCB（42% vs 23%，P<0.001）、更长的PFS（3.22 vs 1.94个月，HR=1.3，P=0.018）和OS（15.67 vs 9.59个月，HR=1.5，P=0.002）。联合TMB后，在TMB-H和TMB-L亚组中，ITH-L均与更好的结局相关，且ITH-L/TMB-H组表现最优，验证了ITH通过ctDNA测量的可行性。
**3.4 Evaluation of the association between ITH and postoperative recurrence and prognosis**
在内部队列（121例手术患者）中，ITH-H组复发率显著高于ITH-L组（24.59% vs 8.33%，P=0.016）。ITH-L组中位RFS显著更长（未达到 vs 68个月，HR=0.3，P=0.014），且在接受辅助治疗的患者中趋势一致（未达到 vs 46个月，HR=0.3，P=0.03）。多变量Cox回归显示，ITH-H是术后复发的独立危险因素（HR=3.39，P=0.024），与年龄和T分期共同显著。
**3.5 Association of ITH with genetic profiles and immune cell infiltration**
基于TCGA队列，ITH-L组具有更高的TMB（P<0.001）、新抗原（SNV，P=0.002）和亚克隆基因组分数（P<0.001），以及更低的HRD评分（P=0.002）、CNV负荷（P<0.001）和肿瘤纯度（P<0.001）。突变谱分析显示，XIRP2是ITH-L组中最常突变的基因（30.47%），而SHOX2是唯一在ITH-H组中频率更高的基因（4.62% vs 0.23%）。免疫浸润分析表明，ITH-L组中M1巨噬细胞、活化记忆CD4
+ T细胞和初始CD4
+ T细胞比例显著高于ITH-H组，而调节性T细胞（Tregs）也显著增多，提示更有利的免疫微环境。
**讨论与结论**
讨论部分强调，ITH与免疫治疗结局的关联，尤其是与TMB联合使用时，可为患者分层提供更准确的信息。ITH-L可能通过更均匀的新抗原表达和更少的免疫逃逸机制促进免疫应答。通过ctDNA评估ITH的可行性为临床推广提供了经济、非侵入性的手段。在早期NSCLC中，ITH-H与术后复发风险增加独立相关，尽管在I期患者中未达统计学差异，但趋势一致，提示其潜在风险分层价值。基因组特征分析揭示了ITH-L组中更高的TMB和亚克隆分数，以及更低的HRD和CNV负荷，这些特征可能共同塑造了更均一的免疫原性肿瘤结构。XIRP2突变在ITH-L组中的富集值得进一步验证。免疫浸润的差异表明ITH-L肿瘤具有更活跃的免疫微环境，这可能是其更好免疫治疗反应的基础。研究结论翻译如下：总之，本研究强调了ITH作为潜在预测因子的重要性，特别是与TMB联合时，用于NSCLC免疫治疗疗效预测。研究人员阐明了ITH影响生物学特征和肿瘤免疫微环境的分子机制。研究结果支持进一步评估ITH，尤其是与TMB联合，作为NSCLC免疫治疗分层的潜在生物标志物。此外，通过ctDNA进行ITH评估可能为组织检测提供实用且非侵入性的补充，但其临床应用需要进一步验证。
