《Frontiers in Plant Science》：Development and validation of whole-genome SSR markers in sugar beet (Beta vulgaris L.)
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摘要：甜菜（Beta vulgaris L.）是全球重要的糖料作物和经济作物。为系统表征甜菜各染色体上的SSR（简单序列重复）位点并实现种质资源的精确鉴定，本研究对甜菜基因组进行了全基因组SSR位点扫描，分析了其分布规律，并利用123份甜菜品种的重测序数据确定
摘要：甜菜（Beta vulgaris L.）是全球重要的糖料作物和经济作物。为系统表征甜菜各染色体上的SSR（简单序列重复）位点并实现种质资源的精确鉴定，本研究对甜菜基因组进行了全基因组SSR位点扫描，分析了其分布规律，并利用123份甜菜品种的重测序数据确定了其基因型。结果表明，甜菜基因组中含有丰富的SSR位点，共鉴定到135,379个SSR位点，并据此设计出135,344对SSR引物（135,344对引物成功设计；35个位点未达到设计标准）。具体而言，31,748对引物基于未定位到染色体支架上的SSR设计，103,596对引物来自定位到9条染色体上的SSR。通过生物信息学分析，研究人员鉴定到28,768个位于多拷贝基因中且PIC（多态性信息含量）≥ 0.5的SSR引物，以及2,326个位于单拷贝基因各基因区域中的SSR标记（其中543个PIC ≥ 0.5，最高达0.776）。PCR（聚合酶链式反应）验证确认了20个条带清晰、可重复且具有多态性的稳健标记。其中，位于多拷贝基因中的10个SSR引物表现出3种或以上的多态性类型，位于单拷贝基因中的10个标记呈现2–3种多态性类型。多态性最高的标记YCD-4-2在48份品种中检测到11种多态性类型。此外，为发掘具有潜在功能意义的标记，研究人员对位于单拷贝基因中的SSR标记所携带的基因进行了功能注释。结果显示，位于单拷贝基因中的1,264个SSR定位于967个基因上，这些基因显著富集于碳水化合物代谢、胁迫响应以及植物-病原互作相关通路。本研究提供的20个验证标记及2,326个位于单拷贝基因中的SSR可直接应用于甜菜品种指纹图谱构建、种子纯度检测和标记辅助选择，是分子育种的实用资源。
**甜菜全基因组SSR标记开发与验证研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
甜菜（Beta vulgaris L.）是全球重要的糖料作物，提供了约21%的全球食糖产量，仅次于甘蔗。经过近两百年的育种改良，现代栽培品种的含糖量已从最初的约8%提升至约18%。我国自1906年大规模引进甜菜以来，形成了以东北、华北和西北为主要产区的生产格局，其中华北地区栽培面积约占全国总面积的65%。然而，中国并非甜菜原产地，缺乏野生种质资源，遗传多样性较低，这严重制约了甜菜种质资源的收集、评价与利用效率。随着2014年甜菜参考基因组序列的完成，全基因组水平上的分子标记开发成为可能。SSR标记作为一种基于PCR的共显性分子标记技术，具有操作简便、重复性好、多态性高等优势，在遗传图谱构建、遗传多样性分析和标记辅助选择中广泛应用。然而，SSR标记具有物种特异性，其开发效率直接受限于基因组序列信息的完整性。传统基于转录组数据开发的EST-SSR标记往往存在多态性低、扩增效率不高的问题，且难以准确判定SSR侧翼序列在基因组中的拷贝数。因此，基于全基因组重测序数据系统开发高多态性、位点特异性强的SSR标记，对于甜菜种质资源鉴定和分子育种实践具有重要的理论意义和应用价值。本研究依托123份国外引进甜菜品种的重测序数据，开展全基因组SSR标记的挖掘、筛选与验证，旨在建立一套覆盖全基因组的高效SSR标记资源库。
**二、研究内容与技术方法**
研究人员利用123份来自六家育种公司（KWS SAAT SE、Strube、Lion Seeds Ltd.、SES VanderHave、MariboHillesh?g Aps和BETASEED）的国外引进甜菜品种为材料，基于Illumina NovaSeq X Plus?平台进行全基因组重测序，平均测序深度达13.01×，平均基因组覆盖率为87.36%。关键技术方法包括：利用MISA v2.1软件进行全基因组SSR位点挖掘；采用Primer3批量设计SSR引物；运用Diamond软件进行全蛋白序列比对以鉴定单拷贝与多拷贝基因；结合HipSTR进行基因分型，并使用Cervus 3.0.7计算观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和多态性信息含量（PIC）；利用R语言的clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析；最终通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR实验验证。
**三、研究结果**
**3.1 测序数据比对结果。** 123份甜菜品种共获得252 GB原始测序数据，平均每样本21,321,454条reads，过滤后平均测序深度13.01×，平均基因组覆盖率87.36%，数据质量满足后续分析要求。
**3.2 甜菜基因组中SSR位点特征。** 共鉴定到135,379个SSR位点，其中chr6所含SSR位点最多（16,609个），chr3最少（8,067个）。单核苷酸重复最为丰富，共73,832个，占54.54%；二核苷酸和三核苷酸重复分别占12.87%和6.70%；复合SSR和不完美SSR共占14.53%。
**3.3 甜菜全基因组SSR引物开发。** 成功设计135,344对SSR引物，设计成功率达99.97%。其中103,596对定位于9条染色体上，染色体总体引物频率为275.1对/Mb。chr3引物频率最高（303.6对/Mb），chr9最低（264.4对/Mb）。
**3.4 多拷贝基因SSR引物的染色体分布分析。** 筛选出28,768个位于多拷贝基因中且PIC ≥ 0.5的SSR引物。chr6所含高多态性标记最多（5,655个，占19.7%），chr5和chr7分别占17.7%和13.7%，而chr1–4各仅含约1,800个标记，表明高多态性SSR标记在甜菜基因组中非随机分布。
**3.5 单拷贝基因SSR标记的筛选及位置分析。** 共鉴定2,326个位于单拷贝基因中的SSR，仅占可设计引物SSR标记的1.72%。其中单核苷酸重复最多（844个，36.3%），二核苷酸重复403个（17.3%）。位置分析显示290个完全位于编码区，606个位于内含子，787个主要位于上下游区域，48个位于UTRs，其余595个跨两个区域。
**3.6 单拷贝基因SSR标记的染色体分布与多态性分析。** 2,326个单拷贝SSR标记在9条染色体上分布不均，chr4最多（360个），chr8最少（156个）。chr3的Ho、He和PIC值最高（0.56、0.43和0.36），chr7最低（0.42、0.34和0.28），所有染色体均达到中等多态性水平。
**3.7 单拷贝基因SSR相关基因的功能注释与通路富集分析。** 1,264个SSR成功定位于967个具有明确功能描述的基因上。这些基因显著富集于碳水化合物代谢和胁迫响应通路，包括编码丙酮酸脱氢酶激酶（LOC104889154）和碳水化合物磷酸酶等糖代谢相关酶类的基因，以及参与植物-病原互作和蛋白泛素化等过程的基因。
**3.8 SSR引物有效性验证及多态性分析。** 从48对候选引物中筛选出20对条带清晰、可重复且具有多态性的标记。在多拷贝基因相关标记中，YCD-4-2在48份品种中检测到11种多态性类型，多态性最高；单拷贝基因相关标记YCS-7-5检测到8种类型。计算预测与实验观测的PIC值差异可归因于样本量缩减、纯化选择效应以及凝胶电泳分辨率限制等因素。
**四、讨论与结论**
本研究基于123份甜菜品种的全基因组重测序数据，构建了包含135,344对引物的全基因组SSR标记资源库，其中包含28,768个多拷贝基因中的高多态性标记（PIC ≥ 0.5）和2,326个单拷贝基因SSR标记。经实验验证获得20个条带清晰、重复性好、具有多态性的实用标记，其中多态性最高的标记YCD-4-2在48份品种中检测到11种多态性类型。543个PIC ≥ 0.5的单拷贝基因SSR可作为QTL定位和关联分析的优先候选标记。这些标记可直接应用于甜菜品种指纹图谱构建、种子纯度检测和标记辅助选择，为甜菜分子育种提供了实用资源。研究还发现多拷贝SSR标记与单拷贝SSR标记在育种应用中具有互补价值，前者适用于种质鉴定和遗传多样性分析，后者凭借位点特异性优势更适合精细QTL定位和基因功能研究。转录组数据因缺乏完整基因组结构信息难以准确判定SSR侧翼序列的拷贝数，而全基因组重测序方法有效克服了这一局限。本研究在甜菜中首次系统筛选了单拷贝基因SSR标记，并通过实验验证了其有效性，为后续甜菜分子标记辅助选择育种和重要性状遗传解析奠定了重要基础。
