miR-204-5p通过调控IL-11/ERK1/2-NF-κB轴减轻早期慢性肾移植物功能障碍中的炎症浸润

《Frontiers in Immunology》：miR-204-5p attenuates inflammatory infiltration in early-stage chronic renal allograft dysfunction by modulating the IL-11/ERK1/2-NF-κB axis

　　

摘要
背景：慢性肾移植物功能障碍（CRAD）持续限制移植肾的长期存活。CRAD早期阶段的炎症细胞积聚可能加速纤维化重塑和移植物功能障碍，尽管驱动该过程的调控机制尚未完全阐明。白细胞介素-11（IL-11）日益被认为是纤维炎症介质，但miRNA依赖性调控IL-11是否参与CRAD早期相关炎症仍不清楚。本研究旨在探讨miR-204-5p是否通过靶向IL-11调控CRAD的早期炎症损伤。
方法与结果：通过原位肾移植建立大鼠CRAD模型，并在移植后12周收集肾组织以评估早期炎症和纤维化变化。使用IL-11-shRNA AAV在体内抑制IL-11表达，并使用mmu-miR-204-5p AAV过表达miR-204-5p。进行组织学染色、免疫组织化学、RT-qPCR、ELISA和肾功能分析。在体外，用TGF-β1刺激BUMPT细胞模拟CRAD相关早期炎症和促纤维化反应。使用中和抗体或siRNA阻断IL-11/IL-11RA信号。使用ERK1/2抑制剂PD98059评估下游通路激活。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-204-5p与IL-11的直接相互作用，并进行重组IL-11的拯救实验以确定IL-11是否介导miR-204-5p的作用。
结论：miR-204-5p通过直接靶向IL-11并抑制IL-11相关的ERK1/2-NF-κB炎症信号，减轻CRAD的早期炎症损伤。miR-204-5p/IL-11轴可能代表CRAD早期炎症损伤的潜在调控通路和治疗靶点。

论文解读：miR-204-5p通过调控IL-11/ERK1/2-NF-κB轴减轻早期慢性肾移植物功能障碍中的炎症浸润

**研究背景与科学问题**

终末期肾病（ESRD）已成为全球性健康问题，2017年美国新增ESRD病例达12.45万例，至2020年患病总数增至80.9万例。肾移植是ESRD的最佳治疗选择，但慢性肾移植物功能障碍（CRAD）仍是导致移植肾长期丢失的主要原因，约占移植后10年内移植物失败的50%。Banff分类强调间质纤维化和肾小管萎缩（IF/TA）是慢性移植物损伤的关键组织病理学特征，而移植物炎症是纤维化进展的重要调控因素。持续存在的移植物炎症可能触发适应不良修复反应，导致基质过度积聚和进行性纤维化，最终引起移植物功能下降甚至衰竭。因此，探索IF/TA过程中炎症的具体机制对改善移植后生存率和降低ESRD发病率至关重要。

白细胞介素-11（IL-11）作为IL-6家族细胞因子，近年来因其在组织损伤和修复中的情境依赖性作用而备受关注。IL-11通过与同源受体和gp130形成相似的六聚体复合物启动信号传导，其下游信号涉及ERK通路的持续激活，从而促进肾纤维化。鉴于IL-11在肾脏中的高表达，研究人员推测IL-11可能在CRAD中也激活ERK通路并影响纤维化过程中的炎症浸润。此外，非编码RNA（ncRNA）尤其是microRNA（miRNA）在肾脏病理过程中发挥重要调控作用。其中miR-204-5p已被报道参与糖尿病肾损伤保护、高糖诱导的系膜细胞损伤以及肾纤维化相关通路，但其在CRAD早期炎症中的调控作用及与IL-11的关联尚不清楚。因此，本研究旨在阐明IL-11调控CRAD早期炎症浸润的具体机制，以及miRNA如何调控IL-11表达。

**研究内容与主要发现**

研究人员建立了大鼠原位肾移植CRAD模型，在移植后12周收集肾组织评估早期炎症和纤维化变化。通过IL-11-shRNA AAV体内抑制IL-11表达，通过mmu-miR-204-5p AAV过表达miR-204-5p。结果显示，早期CRAD肾脏呈现显著的肾小管间质损伤、炎症细胞浸润、胶原沉积和纤维化重塑，同时IL-11表达上调，p-ERK和p-p65水平升高，CD68阳性巨噬细胞积聚增加。抑制IL-11可减轻这些病理改变并改善肾功能。体外实验中，TGF-β1刺激BUMPT细胞模拟CRAD相关炎症和促纤维化反应，中和IL-11或IL-11RA或siRNA敲低均可抑制炎症介质表达。ERK1/2抑制剂PD98059可抑制NF-κB激活和炎症介质产生。双荧光素酶报告基因实验证实miR-204-5p直接靶向IL-11的3'-UTR。体内过表达miR-204-5p可减轻CRAD大鼠的炎症浸润、纤维化重塑和肾功能障碍。

**关键技术方法**

本研究采用了多种关键技术方法。动物模型方面，使用F344大鼠作为供体、Lewis大鼠作为受体进行同种异体原位肾移植，以Lewis-to-Lewis移植作为假手术对照，术后第10天行对侧肾切除，于移植后12周收集样本。体内干预使用IL-11-shRNA腺相关病毒（AAV）和mmu-miR-204-5p过表达AAV通过尾静脉注射，PD98059腹腔注射抑制ERK1/2。体外实验使用小鼠肾小管上皮细胞系BUMPT，以TGF-β1（5 ng/mL）刺激24小时模拟CRAD相关炎症反应。采用免疫荧光、Western blotting、RT-qPCR、ELISA、组织学染色（H&E和Masson三色）、免疫组化、双荧光素酶报告基因实验等方法。miRNA靶标预测利用miRDB、miRwalk和TargetScan三个数据库取交集。肾功能通过血清肌酐和血尿素氮水平评估。

**主要研究结果**

**1. IL-11抑制减轻早期CRAD的肾炎症浸润和损伤**

通过原位肾移植建立早期CRAD模型，与假手术组相比，CRAD大鼠肾组织表现出明显病理损伤：H&E染色显示肾小管间质结构损伤和炎症细胞浸润，Masson染色显示胶原沉积和纤维化重塑增加。免疫组化显示CRAD肾脏IL-11表达显著升高，p-ERK、p-p65和CD68阳性巨噬细胞积聚增加。IL-11-shRNA AAV处理可降低IL-11表达，减少p-ERK和p-p65水平，减轻CD68阳性炎症细胞浸润，同时降低血清肌酐和血尿素氮水平，改善肾功能。RT-qPCR和ELISA结果进一步证实IL-11敲低降低了MCP-1和MMP-9的表达。

**2. IL-11/IL-11RA信号促进TGF-β1刺激的BUMPT细胞炎症激活**

免疫荧光证实BUMPT细胞表达IL-11RA。TGF-β1刺激显著增加IL-11、IL-11RA和炎症介质（MCP-1、MMP-9、ICAM-1、IL-1β）的蛋白和mRNA表达。使用抗IL-11或抗IL-11RA中和抗体处理后，TGF-β1诱导的炎症介质上调被减弱。siRNA敲低IL-11或IL-11RA同样抑制了炎症介质的表达和分泌，表明IL-11/IL-11RA信号参与肾小管上皮细胞的炎症激活。

**3. ERK1/2抑制减弱早期CRAD的NF-κB激活和炎症损伤**

CRAD大鼠经PD98059处理后，肾组织病理损伤减轻，纤维化面积减少。免疫组化显示PD98059显著降低p-ERK和p-p65表达，减少CD68阳性巨噬细胞积聚。PD98059同时降低血清肌酐和血尿素氮水平，下调MCP-1和MMP-9的mRNA和蛋白表达。值得注意的是，PD98059对IL-11表达影响较小，表明IL-11可能作用于ERK1/2激活的上游。

**4. IL-11通过ERK1/2-NF-κB相关信号促进BUMPT细胞炎症激活**

在体外，TGF-β1和重组小鼠IL-11（rmIL-11）均能增加p-ERK/ERK和p-p65/p65水平，并上调炎症介质表达。PD98059剂量依赖性抑制TGF-β1和rmIL-11诱导的ERK1/2和NF-κB激活，降低MCP-1、MMP-9、ICAM-1和IL-1β的表达和分泌。证实IL-11通过ERK1/2-NF-κB信号轴促进炎症反应。

**5. miR-204-5p直接靶向IL-11并减轻TGF-β1刺激的BUMPT细胞炎症介质表达**

生物信息学预测结合双荧光素酶报告基因实验证实miR-204-5p直接结合IL-11 3'-UTR。TGF-β1降低miR-204-5p表达并增加IL-11 mRNA水平。miR-204-5p mimic转染恢复miR-204-5p丰度，降低IL-11表达，并抑制TGF-β1诱导的MCP-1、MMP-9、ICAM-1和IL-1β表达及分泌。

**6. rmIL-11部分逆转miR-204-5p mimic的抑制效应，miR-204-5p过表达减轻体内肾炎症损伤**

拯救实验中，miR-204-5p mimic降低TGF-β1诱导的ERK1/2和NF-κB激活，rmIL-11添加部分恢复了p-ERK和p-p65水平，并部分逆转了炎症介质的抑制。体内实验中，mmu-miR-204-5p AAV处理CRAD大鼠后，肾组织病理损伤减轻，纤维化面积减少，IL-11、p-ERK、p-p65和CD68阳性面积降低，血清肌酐和血尿素氮水平下降，肾组织中miR-204-5p表达升高，IL-11、MCP-1和MMP-9水平降低。

**讨论与结论**

本研究在移植后12周的时间点采集肾组织，该阶段可检测到炎症浸润、肾功能损伤和早期纤维化重塑，但尚未发展为不可逆的晚期纤维化，为研究CRAD早期炎症事件提供了合适窗口。研究人员提出miR-204-5p/IL-11调控轴参与CRAD早期炎症损伤。IL-11作为促纤维炎症介质，通过IL-11RA和gp130受体复合物激活下游ERK1/2-NF-κB信号。研究证实IL-11敲低可减轻炎症和纤维化，ERK1/2抑制可阻断NF-κB激活和炎症介质表达。miR-204-5p通过直接靶向IL-11 3'-UTR抑制其表达，从而限制ERK1/2-NF-κB相关炎症激活。体内过表达miR-204-5p可减轻巨噬细胞浸润、纤维化重塑和肾功能障碍。

从转化角度看，miR-204-5p/IL-11轴可能为调节CRAD早期炎症损伤提供潜在靶点。与广泛免疫抑制相比，靶向特定纤维炎症信号通路可能提供更特异的方法来限制早期炎症放大和后续纤维化重塑。然而，基于miRNA的治疗策略在递送效率、组织特异性、稳定性、脱靶效应和长期安全性方面仍面临挑战。

本研究存在局限性：动物实验样本量有限；缺乏人类肾移植样本验证临床相关性；体内实验缺乏匹配的乱序AAV对照；TGF-β1刺激的BUMPT细胞模型仅捕获上皮细胞内在反应，无法模拟移植物微环境中的免疫细胞串扰。未来需要时间过程实验、gp130通路探究和受体阻断方法以更精确地定义IL-11信号动态。

结论：miR-204-5p通过直接靶向IL-11并抑制IL-11相关的ERK1/2-NF-κB炎症信号，减轻CRAD的早期炎症损伤。miR-204-5p/IL-11轴可能代表CRAD早期炎症损伤的潜在调控通路和治疗靶点。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。