污水来源的鱼肠道细菌绿色合成银纳米颗粒及其抗产AmpC-β大肠杆菌的抗菌潜力

《Frontiers in Nanotechnology》：Green-synthesised silver nanoparticles using sewage-derived fish gut bacteria with antibacterial potential against AmpC-β producing Escherichia coli

　　

微生物介导的银纳米颗粒（AgNPs）绿色合成代表了传统化学方法的环保替代方案，通过利用生物还原剂和稳定剂。在本研究中，从污水暴露的鱼中分离的肠道细菌被用于合成AgNPs，并对所得纳米颗粒的抗菌和抗氧化活性进行了评估。研究人员利用细菌生物量还原1 mM AgNO₃溶液中的Ag⁺离子。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）确认了纳米颗粒的形成和表征。从淡黄色到棕色的明显颜色变化以及约350–400 nm的特征吸收峰证实了AgNPs的合成。TEM分析显示主要为球形纳米颗粒，尺寸范围为10–30 nm。生物合成的AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌（包括产AmpC的大肠杆菌（Escherichia coli））表现出抗菌活性，抑制区范围为24–31 mm。合成的纳米颗粒在DPPH和ABTS⁺自由基清除活性方面表现出强烈的剂量依赖性抗氧化活性，IC₅₀分别为18 μg/mL和39 μg/mL。这些发现表明污水鱼肠道细菌作为生产具有抗菌剂应用前景的生物活性AgNPs的可持续来源的潜力。

**论文解读：污水鱼肠道细菌绿色合成银纳米颗粒对抗产AmpC-β大肠杆菌的抗菌潜力**

**研究背景与问题**

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球公共卫生重大挑战，削弱现有抗生素疗效并加剧感染性疾病流行。其中，产AmpC β-内酰胺酶的大肠杆菌（Escherichia coli）因能水解包括头孢菌素和单环β-内酰胺类在内的多种β-内酰胺抗生素而尤为令人担忧。质粒介导的AmpC酶进一步促进了耐药基因在临床和环境中的快速水平转移，导致治疗选择大幅减少，亟需开发新型抗菌策略。纳米技术为应对多重耐药菌提供了新途径，银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性、高比表面积及多靶点作用机制而备受关注，可降低耐药性发展风险。然而，传统物理化学合成方法常涉及有毒化学品、高能耗和环境风险。作为可持续替代方案，绿色合成利用生物系统（如植物、酶、微生物）还原金属离子形成纳米颗粒。细菌因其快速生长、代谢多样性和产生还原/稳定生物分子能力而被视为适合纳米颗粒生物合成的生物媒介。但以往研究多集中于已充分表征的微生物菌株，而环境适应微生物仍未被充分探索。污水水域中生长的鱼类肠道微生物群是微生物多样性的未开发资源，这些微生物暴露于重金属、药物和有机废物等污染物，可能产生独特的生理代谢适应，如毒性化合物抗性和高酶活性，使其成为纳米颗粒合成的理想候选者。因此，本研究旨在探索从污水鱼肠道分离的细菌用于绿色合成AgNPs，评估其对产AmpC β-内酰胺酶大肠杆菌的抗菌活性，并表征所合成纳米颗粒。

**研究内容与结论**

研究人员从印度阿萨姆邦古瓦哈蒂市污水水体中采集的斑鳢（Channa punctata）肠道中分离出47株细菌，筛选出一株对大肠杆菌（ATCC 11229）具有拮抗活性的菌株RGUS1，经16S rDNA测序鉴定为与苏云金芽孢杆菌（Bacillus tropicus）高度相似（99.27%），并提交至GenBank（登录号PZ529495）。利用该菌株的细菌生物量还原1 mM AgNO₃溶液合成AgNPs，通过UV-Vis、FE-SEM、EDX、HR-TEM、XRD、SAED和DLS进行表征。所合成AgNPs对革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌）以及产AmpC β-内酰胺酶大肠杆菌均表现出显著抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为6–128 μg/mL，且对产AmpC菌株的MIC（128 μg/mL）远低于氨苄西林（256 μg/mL）。此外，AgNPs在DPPH和ABTS⁺自由基清除实验中表现出剂量依赖性抗氧化活性，IC₅₀分别为18 μg/mL和39 μg/mL。研究表明，污水鱼肠道细菌可作为可持续来源生产具有抗菌和抗氧化活性的生物AgNPs，为对抗AMR提供新策略。该论文发表在《Frontiers in Nanotechnology》。

**关键技术与方法**

本研究采用微生物介导的绿色合成方法，主要技术包括：从印度古瓦哈蒂市污水水体中采集斑鳢（Channa punctata）样本（共5个标本，来自不同地点），无菌分离肠道内容物，通过稀释涂布法在TSA平板上分离细菌；筛选具有拮抗活性的菌株（RGUS1），并进行16S rDNA分子鉴定；利用细菌湿生物量（约3 g）在1 mM AgNO₃溶液中室温振荡孵育72小时合成AgNPs；通过UV-Vis光谱（300–800 nm）、FE-SEM（含EDX）、HR-TEM（300 kV）、XRD（Cu Kα辐射，2θ范围）和DLS（Zetasizer）进行纳米颗粒表征；采用琼脂孔扩散法和琼脂稀释法分别评估抗菌活性和MIC；采用DPPH和ABTS⁺自由基清除实验评估抗氧化活性。

**研究结果**

**3.1 细菌拮抗活性筛选与鉴定**
从47株分离菌中筛选出一株对大肠杆菌ATCC 11229具有拮抗活性的菌株RGUS1，通过16S rDNA测序鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus tropicus），与苏云金芽孢杆菌群（B. cereus group）成员高度同源，序列提交至GenBank（登录号PZ529495）。

**3.2 银纳米颗粒的合成与表征**
- **3.2.1 UV-Vis分析**：在72小时后观察到颜色从淡粉色变为深棕色，UV-Vis光谱在约350–400 nm处出现表面等离子共振（SPR）吸收峰，证实AgNPs形成。
- **3.2.2 FE-SEM分析**：显示纳米颗粒呈不规则至半球形，表面粗糙，存在聚集，表明生物分子介导的还原和稳定化。
- **3.2.3 EDX分析**：在约3 keV处出现强银峰，同时检测到C、O、N、S元素，提示生物分子（蛋白质、酶等）参与还原和稳定。
- **3.2.4 HR-TEM分析**：揭示纳米颗粒主要为球形，略微椭圆，平均粒径16.56 ± 4.6 nm，主要分布10–30 nm，多分散性为27.77%，边缘可见有机包覆层。
- **3.2.5 XRD分析**：在2θ = 38.24°、44.39°、64.51°和77.44°处出现衍射峰，对应面心立方（FCC）结构的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，与JCPDS 04-0783标准吻合，证实高结晶性。
- **3.2.6 SAED分析**：显示同心衍射环，对应(111)、(200)、(220)和(311)晶面，支持多晶特性，与XRD结果一致。
- **3.2.7 DLS分析**：Z-平均流体动力学直径为38.48 nm，PDI为0.436，主要种群（90.9%）平均直径为59.86 nm，存在少量小颗粒（4.36 nm，6.1%）和较大聚集体（4005 nm，3.0%）。

**3.3 抗菌活性**
琼脂孔扩散法显示，AgNPs对所有测试菌株产生抑制区24–31 mm，其中对大肠杆菌ATCC 11229抑制区最大（31.33 ± 2.8 mm），对产AmpC大肠杆菌为28.33 ± 3.6 mm。MIC测定显示，AgNPs对金黄色葡萄球菌最敏感（6 μg/mL），对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌均为32 μg/mL，对产AmpC菌株为128 μg/mL，远低于氨苄西林（256 μg/mL）。抗生素敏感性谱显示该产AmpC菌株对头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明耐药，仅对头孢吡肟和亚胺培南敏感。

**3.4 抗氧化活性**
DPPH实验中，在10–30 μg/mL浓度范围内，AgNPs的抑制率从约38%升至约59%，IC₅₀为18 μg/mL（抗坏血酸为11 μg/mL，细菌提取物为24 μg/mL）。ABTS⁺实验中，在10–100 μg/mL范围内，AgNPs的抑制率从约29%升至约95%，IC₅₀为39 μg/mL（BHT为34 μg/mL，细菌提取物为42 μg/mL）。所有样品均表现出浓度依赖性，多项式回归R² = 0.991–0.999。

**讨论与结论**

**讨论总结**：研究人员利用从污水鱼肠道分离的Bacillus tropicus RGUS1成功合成AgNPs。该菌株产生的胞外酶、肽类和次级代谢产物作为还原和稳定剂。UV-Vis SPR峰、FE-SEM形貌、EDX元素组成、HR-TEM尺寸分布、XRD/SAED晶型及DLS流体动力学直径均证实了纳米颗粒的稳定性与多分散性。AgNPs对产AmpC大肠杆菌的高抗菌活性归因于多靶点机制，如膜破坏、ROS生成、蛋白质硫醇基团相互作用及DNA复制干扰，而对β-内酰胺类抗生素的耐药性因酶促水解而无效。不同MIC差异与革兰氏阳性/阴性菌细胞壁结构差异有关，产AmpC菌株较高的MIC可能源于外膜通透性降低或外排泵活性。AgNPs的抗氧化活性源于纳米尺度表面效应及表面吸附的生物分子（如还原性基团），DPPH和ABTS⁺实验中的剂量依赖性响应证实了其自由基清除能力，IC₅₀值低于细菌提取物，表明纳米化增强了氧化还原潜力。

**研究结论**：本研究展示了利用从斑鳢（C. punctata）肠道微生物群中分离的Bacillus tropicus进行AgNPs有效绿色合成的方法。通过视觉观察、UV-Vis光谱、电子显微镜、能量色散X射线、X射线衍射和选区电子衍射分析，确认了稳定、主要为球形、结晶性AgNPs（16.56 ± 4.6 nm）的形成，这些颗粒具有生物分子介导的包覆，且多分散性适中（10–30 nm范围）。该研究证实了纳米级银核纳米结构的合成，其对包括产AmpC大肠杆菌在内的菌株表现出广谱抗菌活性，通过膜破坏和氧化应激诱导等多模态机制发挥抗耐药性潜力。此外，DPPH和ABTS⁺实验中的剂量依赖性抗氧化活性表明，纳米尺度表面效应与生物功能涂层共同提升了氧化还原电位。这些发现表明，利用细菌代谢物合成的生物源AgNPs可作为抗菌制剂、伤口管理、表面消毒和生物膜控制等领域的候选材料。然而，本研究仅限于物理化学表征和体外生物学评估，未进行细胞毒性、生物相容性、生物分布、生物利用度及长期环境/生物安全性研究。因此，在应用于生物医学和临床环境前，需进一步开展体外和体内研究以评估安全性、治疗效力和转化潜力，这对于确立这些生物源AgNPs在纳米医学和感染控制策略中的可行性至关重要。