《Frontiers in Immunology》：Point-of-care assessment of complement activation in the ICU: a feasibility study of rapid terminal complement complex detection in critical illness
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摘要
背景：补体激活日益被认为是多种危重症的关键驱动因素及潜在治疗靶点。然而，检测补体蛋白的传统酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISAs）依赖实验室设备，不适用于急诊和重症监护病房环境中的快速临床决策
摘要
背景：补体激活日益被认为是多种危重症的关键驱动因素及潜在治疗靶点。然而，检测补体蛋白的传统酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISAs）依赖实验室设备，不适用于急诊和重症监护病房环境中的快速临床决策。研究人员在异质性重症监护病房（intensive care unit，ICU）人群中评估了一种用于补体组分C3、激活标志物C3d及可溶性终末补体复合物（terminal complement complex，TCC）检测的即时检测（point-of-care，POC）多重微ELISA平台的可行性。
方法：前瞻性纳入38例危重症患者和3例体外循环患者。15例年龄和性别匹配的健康志愿者作为对照组。使用新型POC多重微ELISA平台分析ICU入院时及第2至4天采集的血浆样本，并与成熟的内部及商业ELISA通过Spearman秩相关和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析进行比较。额外评估了其他补体激活标志物（C3bc、C3bBbP、C1s/C1-INH、MASP-1/C1-INH和C4d）以探究特定通路参与情况。
结果：患者TCC水平（中位数3575，四分位距2048–6504 mAU/ml）显著高于对照组（中位数1286，四分位距1032–1903 mAU/ml；p<0.0001），且在两个采样时间点均如此。POC检测与内部TCC ELISA（r=0.83，p<0.001）及商业Hycult TCC ELISA（r=0.88，p<0.001）均表现出强秩相关。POC TCC检测可准确区分ELISA定义阈值以上和以下的患者样本（AUC 0.97，p<0.001）。相比之下，C3和C3d在患者与对照组间的区分能力有限，且POC与ELISA的一致性较差。患者体内C3bc和C3bBbP升高，提示替代通路放大。C1s/C1-INH和C4d未显著升高，而MASP-1-C1-INH复合物在患者中较健康对照组降低。
结论：即时检测TCC定量切实可行，与成熟ELISA相关性良好，并能准确识别危重症患者中升高的TCC水平。尽管无法进行正式的方法比较分析，但在所评估的POC原型中，TCC是这一ICU队列中最稳健的补体激活标志物。POC检测可能有助于在急性诊疗环境中及时识别补体激活，并支持将补体定向诊断和治疗整合到临床工作流程中。
本论文发表于《Frontiers in Immunology》期刊，题为“Point-of-care assessment of complement activation in the ICU: a feasibility study of rapid terminal complement complex detection in critical illness”（重症监护病房补体激活的即时检测：危重症中快速终末补体复合物检测的可行性研究）。该研究由Oslo University Hospital的研究团队完成，通讯作者包括T. E. Mollnes等补体研究领域的知名学者。
补体系统是人类先天免疫的核心组成部分，通过经典、凝集素和替代三条途径识别并清除病原体和受损细胞，最终汇聚于C3和C5的裂解，产生调理作用、过敏毒素释放以及终末补体复合物（TCC/C5b-9）的组装。补体系统失调与多种炎症性和血栓性疾病密切相关。近年来，补体靶向治疗领域经历了革命性发展，已有14种补体调节药物获FDA批准用于11种不同疾病的治疗，大量超说明书使用进一步凸显了临床对补体干预的需求。随着补体靶向治疗进入临床实践，快速可靠的补体激活检测方法变得至关重要。然而，传统的酶联免疫吸附试验（ELISA）耗时长且依赖实验室基础设施，难以满足急诊和重症监护环境中及时识别可治疗表型、指导临床决策和监测治疗反应的需求。即时检测（POC）平台有望缩小这一诊断差距。
针对上述问题，研究人员开展了一项探索性可行性研究，评估了一种由GENSPEED Biotech（奥地利）与Hycult Biotech（荷兰）合作开发的新型POC多重微ELISA平台，用于检测补体组分C3、激活标志物C3d和可溶性TCC的性能。研究前瞻性纳入38例来自混合内科和外科ICU的危重症患者和3例体外循环心脏手术患者，另招募15例年龄和性别匹配的健康志愿者作为对照。患者临床诊断涵盖心脏骤停后自主循环恢复、脓毒症、蛛网膜下腔出血、脑死亡器官捐献者以及子痫前期和镰状细胞危象等微血管病状态。血浆样本在ICU入院时及第2-4天采集，使用POC平台进行分析，并与成熟的内部和商业ELISA进行Spearman秩相关和受试者工作特征（ROC）分析。此外，研究人员还评估了C3bc、C3bBbP、C1s/C1-INH、MASP-1/C1-INH和C4d等上游补体激活标志物，以探究特定通路参与情况。
该研究得出以下主要结论：首先，POC TCC检测在危重症患者中切实可行，与内部ELISA（r=0.83）和商业Hycult ELISA（r=0.88）均表现出强秩相关，且相关性强度与两种ELISA之间的相关性（r=0.94）量级相当。其次，ROC分析显示POC TCC检测能准确识别ELISA定义的TCC升高样本（AUC 0.97），最佳阈值为2744 mAU/ml时灵敏度和特异度分别为100%和86.2%。第三，患者TCC水平显著高于健康对照组，且升高跨越多种疾病类别。相比之下，C3和C3d在POC平台上表现不佳，与ELISA相关性差。上游标志物分析显示C3bc和C3bBbP显著升高，提示替代通路放大参与；而C1s/C1-INH和C4d无显著差异，MASP-1/C1-INH复合物反而降低。这项研究的重要意义在于证明了POC检测终末补体复合物的可行性，为补体靶向诊断和治疗融入急性诊疗工作流程提供了技术基础。
在技术方法方面，研究人员采用了以下关键技术：（1）微流控化学发光多重微ELISA平台，由GENSPEED Biotech开发，采用非接触式微阵列点样技术将TCC、C3和C3d特异性抗体固定于聚合物薄膜上，与微流控顶层超声波焊接形成生物芯片，可在22分钟内自动完成小体积样本分析；（2）样本处理采用EDTA抗凝血浆，立即冰浴并在30分钟内离心以完全终止补体激活，POC分析前样本按1:10稀释；（3）对照检测采用内部夹心ELISA（以mAb aE11捕获C9新表位，生物素化抗C6单抗检测）和商业Hycult ELISA试剂盒；（4）上游补体标志物采用内部ELISA（C3bc和C3bBbP）及商业ELISA试剂盒（C3、C3d、MASP-1/C1-INH复合物、C1s/C1-INH复合物和C4d）定量；（5）统计分析采用Spearman秩相关评估POC与ELISA的一致性，ROC分析评估诊断性能，最佳截断值通过最大化Youden指数确定。
研究结果部分如下：
3.1 研究人群
研究队列包含38例危重症患者和3例体外循环患者，中位年龄54岁，女性占54%。纳入标准基于当前文献中已报道或生物学上认为可能存在补体激活的临床状况，异质性较强，最常见为全身炎症性疾病（34%）、蛛网膜下腔出血包括脑死亡供体（25%）和心脏骤停（17%）。炎症和器官功能障碍标志物升高，平均C反应蛋白135 mg/l，平均肌酐123 μmol/l。ICU住院期间死亡率为32%，首次采样后30天内死亡率为39%。7例患者在2-4天采样前死亡。
3.2 多重POC检测的分析性能
成功建立了TCC、C3和C3d的分析物特异性标准曲线，定量范围分别为TCC 300-40,000 mAU/ml、C3 3-500 μg/ml和C3d 20-8,000 ng/ml。稀释线性以连续至少三个稀释度的CV%评估，TCC、C3和C3d的稀释线性CV分别为23.4%、3.7%和19.2%，均满足预设的≤25%接受标准。回收率实验显示TCC、C3和C3d的回收率分别为82%、88%和98%。批内CV分别≤23%（TCC）、≤18%（C3）和≤20%（C3d），批间变异分别≤20.4%、≤10.7%和≤13.3%。
3.3 TCC、C3和C3d的即时检测结果
POC平台检测的TCC水平在患者中显著高于健康对照组（中位数3575，IQR 2048-6504 vs 1286，IQR 1032-1903 mAU/ml；p<0.0001），入院时（3595 mAU/ml）和2-4天（3554 mAU/ml）两个时间点均显著升高。尽管存在相当大的变异性，但无论基础诊断如何，患者TCC水平均升高。POC检测的总C3水平在患者入院时与健康对照组之间无显著差异（p=0.167）。C3d在68%的样本中低于检测限，在可检测值中患者与对照组无差异。
3.4 与ELISA的相关性
Spearman非参数相关分析显示，POC TCC检测与Hycult ELISA（r=0.88，95% CI 0.82-0.92，p<0.001）和内部ELISA（r=0.83，95% CI 0.75-0.89，p<0.001）均呈强正秩相关。两种ELISA之间同样表现出强相关性（r=0.94）。仅使用每位患者入院样本和健康对照组样本重复分析（n=56）时结果一致。C3 POC与C3 ELISA之间无显著相关（r=0.10，p=0.355），C3d POC与C3d ELISA在25个两种方法均可检测的样本中无显著相关（r=0.34，p=0.08）。
3.5 POC TCC检测的受试者工作特征分析
以内部ELISA为参照方法，将入院患者样本中TCC>0.7 CAU/ml定义为ELISA阳性（56个样本中30个）。POC检测表现出强区分能力，ROC曲线下面积（AUC）为0.97（95% CI 0.93-1.0）。经最大Youden指数确定的最佳POC阈值为2744 mAU/ml，对应灵敏度100%和特异度86.2%。所有健康对照的POC TCC值均低于2744 mAU/ml。
3.6 上游补体激活产物及激活途径的定量
C3bc（共同通路）在入院患者中显著高于健康对照组（中位数13.4 vs 4.8 AU/ml；p<0.0001）。C3bBbP（替代通路放大）同样显著升高（26.1 vs 8.1 AU/ml；p<0.0001）。C1s/C1-抑制物复合物（经典通路）在患者与对照组间无差异（987.0 vs 865.1 ng/ml；p=0.270），C4d（经典和凝集素通路）亦无显著差异（369.3 vs 432.7 ng/ml；p=0.570）。MASP-1/C1-抑制物复合物（凝集素通路）在患者中显著低于对照组（14.2 vs 38.52 ng/ml；p=0.0002）。
在讨论部分，研究人员指出POC TCC检测与两种成熟ELISA均表现出强秩相关，相关强度与两种ELISA之间的相关性相当。然而，相关分析仅评估方向一致性而非数值一致性，POC与ELISA之间在绝对浓度上存在差异，这归因于检测设计和校准的差异，以及补体领域缺乏统一的参考标准。POC平台依赖流动捕获和短反应时间，与ELISA的静态长孵育条件不同。研究人员强调该POC检测不应被视为ELISA的直接替代品，而应作为补体靶向治疗患者评估的辅助工具。
研究结论部分翻译如下：
总之，补体激活在这一异质性但病情严重的ICU队列中普遍存在，且最清晰地反映在终末补体复合物的形成上。可溶性TCC在患者与健康对照之间表现出强区分能力，而同一POC检测中分析的C3和C3d则未表现出这一能力。所评估的POC TCC检测与成熟ELISA方法表现出强相关性，并根据参考内部ELISA对TCC水平升高的患者样本具有极佳的区分能力。然而，检测校准方面的差异排除了正式的方法比较分析，因此无法确定POC检测与ELISA之间的数值一致性。ELISA仍对于详细定量分析必不可少，而POC平台可能为危重症患者补体激活的及时识别和监测提供一种实用的方法。
