多中心实验室研究确定用于蚊虫抗性监测的溴虫氟苯双酰胺和异环虫酰胺区分浓度

《Frontiers in Malaria》：Multi-centre laboratory study to determine discriminating concentrations for broflanilide and isocycloseram resistance monitoring in mosquitoes

　　

摘要引言：区分浓度（discriminating concentrations, DCs）是常规监测杀虫剂敏感性的基础，但尚未针对溴虫氟苯双酰胺（broflanilide）或异环虫酰胺（isocycloseram）这两种新进入病媒控制领域的活性成分建立区分浓度。本研究旨在建立并验证WHO瓶生物测定中用于监测冈比亚按蚊（Anopheles gambiae s.s.）、致死按蚊（An. funestus）、斯氏按蚊（An. stephensi）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）对溴虫氟苯双酰胺和异环虫酰胺敏感性的区分浓度。方法：2024-2025年，在世界卫生组织（WHO）支持下，研究人员开展了一项涉及七个国际实验室的多中心研究，应用通用的WHO区分浓度建立方案，对每个物种的敏感参考品系进行测试。结果：研究人员推荐采用以下值作为溴虫氟苯双酰胺的区分浓度：冈比亚按蚊和埃及伊蚊为10 μg/瓶，致死按蚊为15 μg/瓶，斯氏按蚊为25 μg/瓶。异环虫酰胺的推荐区分浓度为：埃及伊蚊15 μg/瓶，冈比亚按蚊30 μg/瓶，斯氏按蚊50 μg/瓶，致死按蚊60 μg/瓶。讨论：基于本研究获得的经验，研究人员提出了技术建议，以支持未来杀虫剂区分浓度数据的生成和分析。

**论文解读：多中心实验室研究确定蚊虫对溴虫氟苯双酰胺和异环虫酰胺抗性监测的区分浓度**

**研究背景与问题**

世界卫生组织（WHO）推荐常规监测蚊虫种群对杀虫剂的敏感性，以指导基于杀虫剂的病媒控制措施部署。区分浓度（discriminating concentrations, DCs）是这种监测的基础，通常通过WHO瓶生物测定或管测定法，以固定浓度（常为LC₉₉值的两倍）测试，以检测早期抗性迹象。然而，两种新进入病媒控制领域的活性成分——溴虫氟苯双酰胺（broflanilide）和异环虫酰胺（isocycloseram），均属于杀虫剂抗性行动委员会（IRAC）第30类（间二酰胺/GABA门控氯离子通道变构调节剂），其作用机制与拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷和有机氯类不同。此前尚无针对这些化合物的区分浓度被建立。因此，为将这些新杀虫剂纳入常规抗性监测，并验证WHO通用方案的适用性，研究人员开展了这项多中心研究。

**研究内容与结论**

本研究由利物浦热带医学院（LSTM）与WHO协调，联合七个国际实验室（LSTM、法国发展研究所（IRD）、伦敦卫生与热带医学院（LSHTM）、传染病研究中心（CRID）、印度医学研究理事会-国家疟疾研究所（NIMR）、国家传染病研究所（NICD）和伊法卡拉卫生研究所（IHI）），于2024-2025年进行。研究采用三步法：初步瓶生物测定筛选浓度范围以获取0-100%死亡率（Step 1）；通过多中心浓度-反应测试估计LC₉₉和LC₁₀₀，并提出暂定区分浓度（tentative discriminating concentrations, TDCs）（Step 2）；对暂定区分浓度进行多中心验证（Step 3）。研究针对四种主要病媒蚊虫：冈比亚按蚊（Anopheles gambiae s.s.）、致死按蚊（An. funestus）、斯氏按蚊（An. stephensi）和埃及伊蚊（Aedes aegypti），使用完全敏感品系。主要结论为：推荐溴虫氟苯双酰胺的区分浓度为10 μg/瓶（冈比亚按蚊和埃及伊蚊）、15 μg/瓶（致死按蚊）和25 μg/瓶（斯氏按蚊）；异环虫酰胺的区分浓度为15 μg/瓶（埃及伊蚊）、30 μg/瓶（冈比亚按蚊）、50 μg/瓶（斯氏按蚊）和60 μg/瓶（致死按蚊）。这些值将支持国家计划和研究机构将这些杀虫剂纳入抗性监测活动，以应对抗性种群。该论文发表在《Frontiers in Malaria》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用WHO瓶生物测定法，添加表面活性剂油菜籽油甲酯（MERO）（埃及伊蚊1,500 ppm，按蚊属800 ppm），以改善亲脂性化合物的瓶壁包被。应用三步研究设计：Step 1粗略筛选浓度范围；Step 2由三个独立实验室对每个物种-化合物组合进行至少六浓度、三重复的浓度-反应测试，并使用贝叶斯二项式模型（Kont et al., 2023）拟合数据，估计LC₉₉和LC₁₀₀；Step 3由至少三个实验室验证暂定区分浓度，确认对敏感品系实现100%死亡率。样本来源为各实验室维护的敏感参考品系（如Kisumu、FANG、SDA500、New Orleans等），具体分布见表1。所有数据采用统一的WHO方案和分析标准，以确保可比性。

**研究结果**

**3.1 Step 1：初步瓶生物测定筛选一系列杀虫剂浓度范围以获得蚊虫0-100%死亡率**
由LSTM和IRD进行的初步测试确认了24小时瓶干燥时间、1小时暴露和24小时后死亡率作为合适终点，并确定了Step 2的初始浓度范围。

**3.2 Step 2：瓶生物测定建立LC₉₉和LC₁₀₀并提出暂定区分浓度**
共测试62,673只蚊虫（表2A）。通过拟合浓度-反应曲线，研究人员获得了各中心对各物种的LC₉₉估计值及暂定区分浓度（表2）。对于溴虫氟苯双酰胺，冈比亚按蚊、致死按蚊、斯氏按蚊和埃及伊蚊的拟合数据来自多个中心，部分中心数据（如CRID）因无法拟合模型而未生成曲线，但未影响总体推荐。对于异环虫酰胺，同样拟合了多个中心的数据，并观察到不同物种间基线敏感性差异（如冈比亚按蚊和埃及伊蚊LC值较低，致死按蚊和斯氏按蚊较高）。研究人员指出，这种差异可能源于体型、表皮穿透、代谢解毒或靶标敏感性差异，但本研究未设计解析具体机制。

**3.2.1 溴虫氟苯双酰胺**
研究人员分别展示了冈比亚按蚊（图2）、致死按蚊（图3）、斯氏按蚊（图4）和埃及伊蚊（图5）的浓度-反应曲线。拟合模型在较高死亡率水平产生陡峭斜率和窄置信区间，表明一致的浓度-反应关系。

**3.2.2 异环虫酰胺**
类似地，研究人员展示了冈比亚按蚊（图6）、致死按蚊（图7）、斯氏按蚊（图8）和埃及伊蚊（图9）的曲线。部分数据（如LSHTM斯氏按蚊品系）无法拟合，但其他中心数据支持暂定区分浓度推荐。

**Step 3：多中心验证暂定区分浓度对所有蚊虫物种**
研究人员对每个物种-化合物组合提出了暂定区分浓度（表4），并通过至少三个独立实验室测试。多数测试在所有剂量下均实现100%死亡率。唯一例外是NICD对致死按蚊的测试：14 μg溴虫氟苯双酰胺和57 μg异环虫酰胺分别导致98%和93%死亡率；后续重复实验（包括15 μg和60 μg）均实现100%死亡率，因此推荐浓度被认为是合适的。最终推荐区分浓度（表5）为：溴虫氟苯双酰胺——埃及伊蚊10 μg/瓶，冈比亚按蚊10 μg/瓶，致死按蚊15 μg/瓶，斯氏按蚊25 μg/瓶；异环虫酰胺——埃及伊蚊15 μg/瓶，冈比亚按蚊30 μg/瓶，斯氏按蚊50 μg/瓶，致死按蚊60 μg/瓶。

**总结与讨论**

研究人员在讨论部分总结了本研究的意义：成功为两种新杀虫剂建立区分浓度，验证了WHO通用方案，并提供了技术建议。关于观察到的实验室间变异，研究人员指出大部分源于估计不确定性而非真实差异，例如LSTM对致死按蚊异环虫酰胺的LC₉₉估计（290.3 μg/瓶）具有极宽置信区间（164.6-48,940 μg/瓶）和低R2（0.6），表明拟合不佳。研究人员建议通过标准化蚊虫饲养方案、设备和操作培训来减少变异。此外，研究人员提出了四个方面的改进建议：选择浓度时应在LC₉₉附近密集采样以提高估计精度；确保统计功效时需平衡浓度数和重复数；定义区分浓度时应考虑置信区间下限并审慎使用倍增因子；设置区分浓度时，若不同品系间LC值差异大，应保留最高值（除非有明确的质量问题），以避免假阳性抗性报告。

**结论翻译**
本多中心研究验证了WHO发布的通用方案（World Health Organization (WHO), 2026），成功建立并验证了溴虫氟苯双酰胺和异环虫酰胺对冈比亚按蚊、致死按蚊、斯氏按蚊和埃及伊蚊的区分浓度。这是首次为异环虫酰胺建立区分浓度。对于溴虫氟苯双酰胺，所生成的区分浓度反映了之前提出的值，包括不同地点同种敏感蚊虫之间的巨大变异（Lees et al., 2020; Ando et al., 2026）。这些值将使国家规划和研究机构能够将这些杀虫剂纳入其抗性监测活动。