从植物病害到保护剂：茶饼病水提物恢复斑马鱼模型中铜诱导的氧化与炎症损伤

《Frontiers in Nutrition》：From plant disease to protective agent: tea blister blight aqueous extract restore copper-induced oxidative and inflammatory damage in zebrafish model

　　

背景：氧化应激和炎症是慢性疾病发生发展中的关键病理机制。尽管茶饼病降低了商业茶叶品质，但病原菌诱导的胁迫可能增强生物活性酚类和黄酮类化合物的积累，使受感染叶片成为食药同源框架下的潜在资源。本研究旨在评估茶饼病水提物（TBB）对硫酸铜（CuSO₄）诱导的斑马鱼（*Danio rerio*）胚胎氧化和炎症应激的保护作用。方法：将斑马鱼胚胎暴露于3 μM CuSO₄，并同时用浓度为0.3–0.9 mg/mL的TBB进行处理。基于存活率、孵化率和形态学结果评估发育毒性。通过测定丙二醛（MDA）水平和抗氧化酶活性（包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT））评估氧化应激。同时分析了与抗氧化防御、炎症和凋亡相关基因的表达。结果：与CuSO₄暴露组相比，TBB处理使胚胎存活率显著提高12.74–15.81%，孵化率提高46.12–51.38%。TBB还通过增加体长15.38–16.35%和改善静脉窦–动脉球距离10.40–14.80%来减轻CuSO₄诱导的发育毒性。此外，TBB通过降低MDA水平16.74–25.61%以及增强SOD和CAT活性分别31.29–72.35%和69.66–92.37%，显著缓解了氧化应激。基因表达分析显示，TBB上调了抗氧化相关基因（*Mn-sod*、*CAT*和*Gpx1a*），抑制了促炎基因（*TNF-α*、*NF–κB*、*NLRP3*和*IL-1β*），并下调了促凋亡基因*bax*，同时增强了抗炎（*IL-10*）和抗凋亡（*Bcl-2*）基因的表达。结论：这些发现表明，TBB通过抗氧化、抗炎和抗凋亡机制提供多层次的生物保护。重要的是，本研究提供了一个新视角，证明感染茶饼病的茶叶而非被丢弃或仅通过杀菌剂管理，可以作为富含生物活性成分的资源，应用于功能性营养和促进健康的产品中。

## 研究背景与科学问题

氧化应激与炎症是多种慢性疾病发生发展的核心病理机制。当活性氧（ROS）的产生超过机体抗氧化防御系统的清除能力时，过量ROS与脂质、蛋白质和核酸等细胞成分发生反应，破坏氧化还原稳态，导致脂质过氧化、蛋白质变性和DNA突变，进而引发细胞凋亡或坏死。长期氧化应激可通过NF–κB、MAPK等信号通路增强炎症反应，而炎症本身又促进ROS过度产生，形成恶性循环，加剧细胞损伤和组织功能障碍。铜作为人体必需的微量元素，其过量摄入或暴露可通过Fenton反应催化ROS生成，诱导氧化损伤和炎症反应。硫酸铜（CuSO₄）因其明确的作用机制，被广泛用作构建氧化应激动物模型的诱导剂。

茶（*Camellia sinensis*）是全球消费量仅次于水的功能性饮料，富含多酚、儿茶素和氨基酸等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和代谢调节等功效。然而，由坏损外担菌（*Exobasidium vexans* Massee）引起的茶饼病是茶树上最具破坏性的叶部病害之一，可导致33–50%的产量损失，并显著降低茶叶中多酚、儿茶素和咖啡碱等品质成分含量。传统上，茶饼病被视为纯粹的农业灾害，受感染叶片通常被废弃或仅通过杀菌剂进行病害管理。然而，近年来的代谢组学和植物化学研究表明，病原菌侵染可诱导寄主植物次生代谢的重编程，包括黄酮类、酚酸类、生物碱和萜类等生物活性化合物的积累增加，这些化合物具有增强的抗氧化和抗菌活性。这种"病害胁迫诱导的生物活性富集"现象，为将感染叶片转化为功能性资源提供了理论基础。

斑马鱼（*Danio rerio*）因其与人类的高度遗传相似性、胚胎透明性以及适合高通量筛选等特点，已成为评估药物和天然化合物抗氧化、抗炎活性的理想脊椎动物体内模型。然而，关于茶饼病感染叶片水提物（TBB）在体内水平上对氧化应激和炎症损伤的保护作用，此前尚无系统研究。研究人员推测，TBB中由病原菌胁迫诱导富集的生物活性成分可能对CuSO₄诱导的氧化应激和炎症损伤具有多层次的保护效应。本研究利用CuSO₄诱导的斑马鱼胚胎氧化应激模型，系统评估了TBB的发育保护作用及其分子机制，旨在探索茶饼病叶片作为食药同源资源的潜在应用价值。

## 主要技术方法

本研究采用以下关键技术手段：（1）利用液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）技术对TBB进行非靶向代谢物谱分析，鉴定其化学成分组成；（2）基于斑马鱼胚胎急性毒性试验确定TBB半数致死浓度（LC₅₀）及安全浓度范围；（3）通过胚胎发育形态学观察（体长、心率、眼径、静脉窦–动脉球距离）评估发育毒性；（4）采用生化比色法测定氧化应激标志物（SOD、CAT活性及MDA含量）；（5）运用实时荧光定量PCR（qPCR）检测抗氧化、炎症及凋亡相关基因的表达水平。样本来源为贵州省黔南布依族苗族自治州都匀市鸿民茶园采集的具有典型茶饼病症状的茶叶。实验用野生型AB品系斑马鱼购自上海费曦生物科技有限公司。

## 研究结果

### 3.1 TBB代谢物组成分析

代谢物谱分析共鉴定出1167种化合物，归属于11大类化学物质。其中黄酮类化合物最为丰富（348种，占29.82%），包括黄酮醇、黄酮糖苷、黄酮、黄烷酮、黄烷醇、查尔酮和黄烷醇等亚类；酚酸类为第二大类别（182种，占15.60%）；其次是脂类（111种，9.51%）、氨基酸及其衍生物（97种，8.31%）、有机酸（83种，7.11%）和生物碱（79种，6.77%）。此外还包括核苷酸及其衍生物（62种，5.31%）、木脂素和香豆素（51种，4.37%）、萜类（28种，2.40%）、鞣质（27种，2.31%）及其他代谢物。这一结果表明，茶饼病感染可显著富集茶树叶片中具有抗氧化和抗炎潜力的生物活性化合物。

### 3.2 TBB对斑马鱼胚胎存活率、孵化率和死亡率的影响

急性毒性试验显示，TBB在0.2–1 mg/mL浓度范围内未增加胚胎死亡率（10.00–16.67%），但在2 mg/mL时死亡率显著升高至27.78%，4 mg/mL时达93.33%，8–50 mg/mL时致死率达100%。通过回归概率分析计算得出TBB的LC₅₀为2.8 mg/mL（95%置信区间：1.83–4.18 mg/mL）。根据生态毒理学安全阈值原则，选择LC₅₀的十分之一（0.28 mg/mL）附近浓度（0.3、0.6、0.9 mg/mL）作为后续实验浓度。在保护实验中，CuSO₄单独暴露组在144小时（hpf）时存活率降至30.00%，而TBB共处理组的存活率为81.67–83.89%，较CuSO₄组提高了12.74–15.81%。孵化率方面，TBB共处理组在144 hpf时孵化率达95.27–98.70%，较CuSO₄组提高了46.12–51.38%。

### 3.3 TBB对斑马鱼胚胎形态学发育的影响

形态学参数测定显示，CuSO₄暴露显著抑制了斑马鱼幼鱼的发育，心率降低至104次/分，体长缩短至4168 μm，眼径缩小至250 μm，静脉窦–动脉球（SV–BA）距离缩短至282 μm。TBB单独处理组（0.3–0.9 mg/mL）的各项形态学指标与对照组无显著差异，表明该浓度范围无发育毒性。在CuSO₄共处理组中，TBB显著改善了CuSO₄诱导的形态学异常，心率提高了15.38–16.35%，SV–BA距离增加了10.40–14.80%，其中0.9 mg/mL TBB使体长较CuSO₄组显著增加1.37%。

### 3.4 TBB对氧化应激相关生化指标的影响

与对照组相比，CuSO₄暴露使CAT和SOD活性分别显著降低53.18%和56.74%，同时MDA含量增加55.17%，表明CuSO₄诱导了严重的氧化损伤。TBB共处理显著逆转了这些变化：CAT活性较CuSO₄组提高69.66–92.37%，SOD活性提高31.29–72.35%，MDA水平降低16.74–25.61%。线性趋势分析进一步证实了TBB对CAT（R2=0.80）和SOD（R2=0.99）活性的浓度依赖性恢复作用，以及MDA水平的浓度依赖性降低（R2=0.87）。

### 3.5 基因表达分析

#### 3.5.1 氧化应激相关基因

CuSO₄暴露使*CAT*、*Mn-sod*和*Gpx1a*的表达分别显著下调2.93倍、4.66倍和1.61倍。TBB共处理使这些基因的表达较CuSO₄组分别上调2.13–2.84倍、2.56–3.86倍和1.34–1.49倍，且呈浓度依赖性恢复趋势（R2分别为0.89、0.94和0.60）。其中，0.9 mg/mL TBB使*CAT*和*Mn-sod*的表达恢复至与对照组相当的水平。

#### 3.5.2 炎症相关基因

CuSO₄暴露显著上调了促炎基因*TNF-α*（4.48倍）、*NF–κB*（4.17倍）、*NLRP3*（4.48倍）和*IL-1β*（3.6倍）的表达，同时使抗炎细胞因子*IL-10*下调3.5倍。TBB共处理有效抑制了CuSO₄诱导的促炎基因过度表达，*TNF-α*、*NF–κB*、*NLRP3*和*IL-1β*较CuSO₄组分别下调2.68–5.04倍、1.66–3.27倍、2.13–3.38倍和1.89–3.43倍，同时使*IL-10*表达上调1.42–3.32倍。线性趋势分析表明TBB对*NF–κB*（R2=0.93）、*NLRP3*（R2=0.79）、*IL-1β*（R2=0.86）和*IL-10*（R2=0.97）的调节呈浓度依赖性。

#### 3.5.3 凋亡相关基因

CuSO₄暴露使促凋亡基因*bax*显著上调1.7倍，抗凋亡基因*Bcl-2*显著下调2.88倍，表明线粒体凋亡信号通路被激活。TBB共处理使*bax*表达较CuSO₄组下调1.35–1.59倍，*Bcl-2*表达恢复1.44–2.28倍，呈浓度依赖性趋势（R2分别为0.84和0.99）。其中，0.9 mg/mL TBB使*bax*表达恢复至与对照组相当的水平。

## 讨论与结论

本研究结果从多层次机制阐明了TBB的保护作用。在生化水平上，TBB通过增强SOD和CAT活性、降低MDA含量来恢复抗氧化防御系统功能；在转录水平上，TBB上调抗氧化基因（*Mn-sod*、*CAT*、*Gpx1a*）、抑制促炎基因（*TNF-α*、*NF–κB*、*NLRP3*、*IL-1β*）和促凋亡基因*bax*，同时促进抗炎基因*IL-10*和抗凋亡基因*Bcl-2*的表达。这些保护效应与TBB中富含的黄酮类（如槲皮素、山奈酚及其糖苷）、酚酸类（如绿原酸及其异构体）以及其他生物活性成分密切相关。

茶饼病水提物（TBB）在斑马鱼胚胎中表现出针对硫酸铜诱导的氧化应激、炎症和凋亡的多层次保护作用。TBB显著提高了存活率和孵化率，减轻了发育和形态学损伤，降低了MDA积累，并通过增强SOD和CAT活性来加强抗氧化防御。在转录水平上，TBB上调了抗氧化相关基因（*Mn-sod*、*CAT*和*Gpx1a*），抑制了促炎介质（*TNF-α*、*NF–κB*、*NLRP3*和*IL-1β*）和促凋亡基因*bax*，同时促进了抗炎（*IL-10*）和抗凋亡（*Bcl-2*）基因的表达。这些发现表明，感染茶饼病的茶叶是一种富含生物活性成分的资源，在食药同源应用中具有潜在价值。然而，本研究存在一定局限性。TBB作为粗水提物进行评估，产生所观察保护效应的具体活性化合物仍有待鉴定。此外，研究结果来自斑马鱼胚胎模型，不能直接外推至人类。未来的研究应分离和鉴定TBB中的主要生物活性化合物，阐明其分子作用机制，并在考虑营养或功能应用之前，在哺乳动物模型中评估TBB或其活性化合物的安全性和有效性。