Characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates from pigs in Piedmont, Italy, by whole-genome sequencing: insights into antimicrobial resistance 中文标题：基于全基因组测序的意大利皮埃蒙特地区猪胸膜肺炎放线杆菌分离株特征分析：对抗菌药物耐药性的新认识

《Frontiers in Veterinary Science》：Characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates from pigs in Piedmont, Italy, by whole-genome sequencing: insights into antimicrobial resistance

　　

背景：猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）仍是全球生猪生产中主要的呼吸道病原体。现有疫苗的交叉保护作用有限，以及抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）发生率的不断上升，凸显了开展表型与基因组学联合监测以支持有效的局部防控策略的必要性。方法：研究人员对先前在意大利皮埃蒙特地区收集的12株APP分离株进行了研究。通过最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测评估了猪用医学中常用的一组抗菌药物的药物敏感性。利用Illumina技术进行全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），随后进行了耐药基因组谱分析（resistome profiling）和比较基因组学分析。同时，对包括apx毒素基因和荚膜多糖位点在内的毒力相关基因进行了鉴定。结果：表型检测显示，部分菌株对四环素、大环内酯类、β-内酰胺类、泰妙菌素和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶具有耐药性。基因组分析在一个分离株（血清型9/11）中鉴定出四环素和酚类耐药基因（tet、flor），而与大环内酯类和依尔法霉素耐药相关的基因在整个数据集中广泛分布。所有分离株均携带主要的apx毒素基因，其中apxII和apxIII操纵子的分布存在差异。一株血清型9/11分离株在荚膜多糖生物合成位点内存在部分缺失，并通过PCR和测序得到证实。比较基因组学分析还提示，血清型6分离株中存在不同的基因组谱系。结论：表型与基因组学的联合方法为循证抗菌药物使用提供了有价值的见解，并为临床相关的APP田间分离株提供了额外的基因组信息，有助于未来关于AMR和基因组多样性的研究。

论文解读：基于全基因组测序的猪胸膜肺炎放线杆菌分离株特征研究

一、研究背景与科学问题

猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是全球养猪业中最具重要性的呼吸道病原体之一。这种革兰氏阴性菌不仅可引起高发病率和死亡率的急性暴发，还可导致慢性感染，表现为日增重下降、饲料转化效率降低（最高可达26%）以及显著的经济损失，受影响猪群的农场盈利能力降幅最高可达34%。在急性暴发期间，死亡率可达10%。目前，猪胸膜肺炎的农场防控主要依赖疫苗接种计划和抗菌药物（antimicrobial，AM）治疗。然而，现有商品化疫苗存在明显局限性：菌苗（bacterins）通常诱导较强的同源免疫，但在19种APP血清型之间仅提供有限的异源交叉保护；亚单位疫苗虽可减轻临床症状和肺部病变，但仍无法提供完全保护。由于疫苗无法覆盖所有血清型，临床暴发仍可能在新血清型引入时发生，此时抗菌药物治疗成为控制疾病的唯一可行选择。

许多抗菌药物对APP具有活性，首选治疗方案可涉及青霉素类、四环素类、磺胺类和酰胺醇类。第三代或第四代头孢菌素及氟喹诺酮类等药物仅在已证实APP分离株存在抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）时才被允许使用。然而，全球已有大量研究报道了耐药APP菌株的存在。AMR已成为生猪生产中日益严峻的问题，不仅削弱治疗效果，还可能导致死亡率升高。在这一既无法仅靠疫苗也无法仅靠抗菌药物确保完全保护的背景下，明确流行菌株的AMR谱型至关重要，这些数据对于指导循证治疗决策和扩展对临床相关猪病原体AMR的有限认知均具有关键意义。

APP的致病性还取决于其毒力决定因子。其主要致病毒力因子为成孔Apx毒素，可对宿主细胞和组织造成严重损伤。APP产生四种Apx毒素（ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV），其中ApxI兼具强溶血和细胞毒性，ApxII具有中度溶血和细胞毒活性，ApxIII具高细胞毒性但无溶血活性，而ApxIV作为APP特异性毒素，是暴露于APP的标志物。本研究的核心目标是对先前在意大利皮埃蒙特地区局部流行病学调查中获得的APP分离株进行整合的表型和全基因组特征描述，旨在为临床相关田间分离株提供详细的基因组和表型描述。

二、研究设计与关键技术方法

本研究纳入12株冻存复苏的APP分离株，均来源于皮埃蒙特地区不同商业化育肥猪场，血清型分布包括血清型2（3株）、6（3株）、9/11（1株）及其他血清型（5株）。主要技术方法包括：（1）通过肉汤微量稀释法（Sensititre半自动系统）结合临床和实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）判定标准进行最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测，评估对15种抗菌药物的敏感性；（2）采用Illumina HiSeq 2500平台进行全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），获得约150 bp双端读长；（3）利用AMR++流程结合MegaRes数据库进行耐药基因组谱（resistome）分析；（4）通过Unicycler进行de novo基因组组装，使用QUAST评估组装质量，CheckM评估基因组完整性和污染；（5）利用Anvi'o平台进行泛基因组分析，计算平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）并构建最大似然系统发育树（IQ-TREE，1,000次超快自举）；（6）基于自定义毒力基因参考库进行毒力因子谱分析，针对apxI、apxII和apxIII基因组进行序列比对；（7）通过定制Python脚本提取荚膜多糖生物合成（capsular polysaccharide biosynthesis，cps）位点，并以PCR和Sanger测序验证目标区段缺失。

三、研究结果

3.1 表型抗菌药物敏感性谱

MIC检测显示12株APP分离株呈现异质性的AMR谱。大环内酯类耐药方面，替米考星和妥拉霉素各在2/12分离株中检出耐药；泰妙菌素耐药在2/12分离株中检出。β-内酰胺类中，阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林各在2/12分离株中表现为耐药，而所有分离株对头孢噻呋均敏感。卡那霉素耐药在1/12分离株中检出。磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药在2/12分离株中检出。四环素耐药是最常见的表型，在3/12分离株中检出。未检出对恩诺沙星、氟甲喹、大观霉素、氟苯尼考、加米霉素和替地匹罗星的耐药。

3.2 毒力因子谱

毒力因子分析显示APX毒素编码基因在分离株间分布存在差异。apxIB和apxID基因在所有12株分离株中均被检出，与其在RTX毒素分泌和激活中的必需角色一致。apxIC仅在1个分离株中检出。apxIIC和apxIIIA在11/12分离株中存在。APX III分泌装置组分编码基因变异性较大，apxIIIB在6/12分离株中检出，apxIIID在5/12分离株中检出。血清型6分离株倾向于携带更广泛的APX相关基因，而血清型2分离株的毒素基因谱相对减少且变异更大。

3.3 基因型AMR谱分析

基于WGS的耐药基因组谱分析确定了有限但一致的AMR基因组合。四环素和酚类耐药基因（tetB、tetM、flor）仅在1个血清型9/11分离株中检出。大环内酯类耐药相关基因分布更广：16S rRNA甲基化相关耐药基因在6/12分离株中检出；mls23S基因（大环内酯类耐药）和tufAB基因（依尔法霉素耐药）在所有分析分离株中均被检出。这两种决定簇在MegaRes数据库中被分类为"requires SNP"，其存在本身不足以预测耐药表型，因为耐药取决于特定耐药性点突变的发生。

3.4 比较基因组分析与Sanger测序结果

基因组组装质量较高，基因组大小范围为2.22-2.29 Mb，GC含量约41%，N50值在112-171 kb之间，每个组装包含24-37个重叠群。CheckM将所有分离株归入巴斯德菌科（Pasteurellaceae，UID4932），估计完整度为99.66%-99.89%，未检测到污染。基于de novo组装和ANI的比较基因组分析将分离株分配至最近的参考血清型。泛基因组分析显示分离株按血清型聚类，基因存在/缺失谱存在差异，支持同一血清型内存在遗传上不同的谱系。最大似然系统发育树与泛基因组分析结果一致，确认了血清型6内存在可区分的基因组谱系。

一个属于血清型9/11组的分离株在cps位点内表现出部分缺失，通过靶向PCR扩增和Sanger测序验证了cps位点内291 bp区域的缺失。血清型6分离株在泛基因组分析中显示基因存在/缺失模式差异，提示这些菌株具有不同的基因组背景。相比之下，血清型2分离株在cps位点上呈现更保守的基因组谱。

四、讨论与结论

本研究的表型AMR谱显示对多种抗菌药物类别存在耐药，其中四环素耐药频率最高，与既往研究一致。与2015-2022年意大利全国性研究相比（四环素耐药53%、氨苄西林33%、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑23%），本研究的耐药频率相对较低，提示该地区AMR状况相对较轻。

耐药基因组谱与表型之间的部分不一致可能反映了基因表达差异、调控机制或现有数据库未捕获的替代性AMR决定簇。mls23S和tufAB基因虽在所有分离株中检出，但其"requires SNP"特性意味着不能仅凭基因存在预测耐药表型。血清型9/11分离株同时携带最多AMR基因和cps位点部分缺失，虽然不能推断二者之间存在直接关联，但这种共现提示该分离株可能代表一种特殊的基因组谱型。所有组装基因组通过PlasmidFinder分析未发现质粒相关序列，但短读长测序可能无法完整重建所有质粒结构。血清型6分离株的基因组变异性和系统发育亚聚类进一步支持同一血清型内存在可测量的基因组异质性。

总而言之，本研究通过整合抗菌药物敏感性检测与基因组学方法，对来自皮埃蒙特地区的APP临床分离株进行了全面的表型和基因组特征描述，鉴定出AMR决定簇的存在，刻画了主要APX相关毒力基因的分布特征，并揭示了同一血清型内分离株的基因组变异。cps位点部分缺失和血清型6内不同基因组谱系的发现丰富了APP基因组多样性的认知。鉴于研究的描述性特征和有限的分离株数量，这些发现应被视为对临床田间分离株的基因组特征描述，为未来猪胸膜肺炎综合管理策略的制定奠定基础。该研究发表于《Frontiers in Veterinary Science》，为APP的AMR监测和基因组流行病学研究提供了有价值的基础数据。