《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Molecular characterization of mupirocin-resistant MRSA from Germany and South Africa
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摘要
引言：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）是一种具有全球公共卫生重要性的人类病原体。MRSA去定植策略的关键要素之一是使用莫匹罗星（mupirocin），该抗生素
摘要
引言：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）是一种具有全球公共卫生重要性的人类病原体。MRSA去定植策略的关键要素之一是使用莫匹罗星（mupirocin），该抗生素也用于治疗浅表皮肤感染。然而，莫匹罗星耐药（mupirocin-resistant, mupR）-MRSA的出现和全球性增加凸显了开展主动监测以支持循证MRSA控制措施的必要性。本研究调查了来自德国和南非的mupR-MRSA的抗生素耐药性、遗传多样性和质粒谱。
方法：通过分子方法验证了mupR-MRSA菌株的表型鉴定。所有菌株的特征分析包括PCR检测潘顿-瓦伦丁杀白细胞素（Panton-Valentine leucocidin）、免疫逃逸簇基因以及葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A, spa）分型。从每种spa型中选择代表性菌株进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），以确定其克隆谱系和亲缘关系，包括抗生素和毒力基因含量。确定了mupA携带质粒的比较分析、系统发育和分类。
结果：共鉴定出82株mupR-MRSA，其中32株表现出高level莫匹罗星耐药（high-level mupirocin resistance, HmupR），50株表现出低level莫匹罗星耐药（low-level mupirocin resistance, LmupR）。在表现出HmupR和LmupR的菌株中分别鉴定了质粒介导的mupA基因和细菌异亮氨酰-tRNA合成酶（isoleucyl-tRNA synthetase, ileS）基因中的V588F突变。然而，在来自德国的两株菌株中同时检测到mupA和V588F突变。来自德国的mupR-MRSA被归属于CC1、CC5、CC8、CC22、CC30和ST59，而来自南非的菌株则被归入CC8、CC22和CC30。这些菌株携带不同的葡萄球菌染色体盒式染色体mec（staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec）类型（IIa、III、IVa、IVj和V）。值得注意的是，在两个国家均鉴定出mupR CC22-MRSA-IVj和tst阳性的CC30-MRSA-IIa菌株。mupA阳性质粒形成了四个不同的群落，包括两个单例。来自德国菌株的mupA阳性质粒通常携带氨基糖苷类（aac(6')-Ie/aph(2'')-Ia）耐药基因。然而，来自南非菌株的mupA阳性质粒上主要鉴定出β-内酰胺（blaZ）、砷（arsB、arsC、arsR）和铜（mco）耐药基因。
讨论：本研究强调了两个国家中mupA阳性MRSA谱系的遗传多样性和水平基因转移潜力，mupA质粒的区域性聚类进一步支持了这一点。将染色体和质粒介导耐药的基因组监测与抗菌药物使用和临床数据相结合，对于针对性的MRSA感染预防和控制至关重要。
论文解读：德国与南非莫匹罗星耐药MRSA的分子流行病学与质粒特征研究
**研究背景与意义**
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）感染与高发病率和死亡率以及高昂的经济成本相关。减少患者和医护人员中MRSA感染的主要策略之一是鼻内莫匹罗星去定植。莫匹罗星是一种天然抗生素，通过干扰细菌蛋白质合成发挥作用。然而，莫匹罗星耐药（mupirocin-resistant, mupR）-MRSA的出现及其全球流行率上升，主要与医疗机构中莫匹罗星的无限制和长期使用有关。mupR-MRSA可使定植患者和人员的去定植治疗失效，并且莫匹罗星耐药可能通过与其他抗生素耐药基因的共同选择而促进多重耐药性的传播。莫匹罗星耐药分为两个水平：低水平莫匹罗星耐药（LmupR，最低抑菌浓度[MIC]为8–256 μg/ml）由细菌异亮氨酰-tRNA合成酶（ileS）基因的染色体突变（主要是V588F和V631F）引起；高水平莫匹罗星耐药（HmupR，MIC≥512 μg/ml）由携带mupA的质粒介导，mupA编码一种对莫匹罗星亲和力极低的替代异亮氨酰-tRNA合成酶。系统综述数据显示，非洲mupR金黄色葡萄球菌和欧洲mupR-MRSA的流行率均超过10%。然而，关于mupR-MRSA的区域和全球流行病学信息仍然有限。本研究调查了非洲（南非）和欧洲（德国）两个大陆的mupR-MRSA的抗生素耐药性、遗传决定因素、克隆谱系和质粒景观。
**研究方法概述**
研究人员收集了来自德国（n=42，2018-2020年）和南非（n=40，2012-2017年）的mupR-MRSA菌株。德国菌株包括来自当地微生物实验室并转送至罗伯特·科赫研究所国家葡萄球菌和肠球菌参考中心的菌株，以及来自明斯特大学医院临床样本的菌株；南非菌株来自GERMS-SA研究。菌株通过MALDI-TOF MS和PCR确认。抗生素敏感性测试采用VITEK 2自动系统和E-test法。对全部82株菌株进行PCR检测潘顿-瓦伦丁杀白细胞素、免疫逃逸簇基因和spa分型。从每种spa型中选择代表性菌株进行PacBio长读长全基因组测序，使用AMRFinder Plus预测耐药和毒力基因，通过核心基因组比对构建最大似然系统发育树。对SCCmec元件进行结构比较，并使用Plasflow、Mobtyper、MOBSCAN等工具对mupA携带质粒进行比较分析、系统发育和分类。
**研究结果**
**3.1 mupR-MRSA菌株的抗生素敏感性测试**
所有来自德国（n=42）和南非（n=40）的mupR-MRSA均为mecA阳性，且对利奈唑胺、替加环素和万古霉素敏感。98%的菌株对环丙沙星耐药，74%对红霉素耐药，72%对克林霉素耐药，45%对庆大霉素耐药。德国菌株对克林霉素（诱导型耐药）、四环素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑和红霉素的耐药率显著低于南非菌株。E-test结果显示32株菌株为HmupR，50株为LmupR。所有E-test MIC≥1024 μg/ml的菌株均为mupA阳性。VITEK和E-test方法在鉴定LmupR和HmupR方面具有高度一致性（98%）。
**3.2 德国和南非mupR-MRSA的克隆谱系**
德国mupR-MRSA分布于15种spa型，归属于五个克隆复合体（CC1、CC5、CC8、CC22、CC30）和一个单例ST59。南非mupR-MRSA分为11种spa型，归属于CC8、CC22和CC30。13株mupA阳性MRSA中有11株属于CC22，而LmupR（V588F突变）在CC8和CC30中广泛分布。在德国和南非均鉴定出携带lukS-PV/lukF-PV和mupA的MRSA（ST1和ST8）。chp/sak/scn簇在两国CC5、CC22和CC30菌株中普遍存在。
**3.3 代表性mupR-MRSA抗菌药物和毒力基因的检测**
82株mupR-MRSA中有30株（南非13株，德国17株）被选作WGS。在29株菌株中鉴定出喹诺酮耐药决定区突变。CC8-MRSA中的抗生素耐药基因比其他谱系更广泛。砷（arsB、arsC、arsR）和铜（mco）耐药基因在两国CC30-MRSA中鉴定到，也存在于南非mupA阳性CC22-MRSA中，但德国六株CC22-MRSA中有五株缺失。南非CC8-ST239-MRSA携带镉（cadC、cadD）、季铵盐（qacA）和汞（merA、merB、merT）耐药基因，而德国CC8-ST239-MRSA缺乏这些基因。两国CC30-MRSA均携带胶原黏附素（cna）、甘油酯水解酶（geh）和中毒性休克综合征毒素-1（tst）基因。系统发育树显示代表性菌株分为三个主要分支（A：CC30和ST59；B：CC22；C：CC1和CC8），无国家特异性聚类。
**3.4 SCCmec分型**
30株WGS菌株中鉴定出SCCmec IIa、III和IV（IVa、IVd、IVj）类型，包括一株携带SCCmecV或IX的CC1菌株。一株t037-ST239-CC8菌株（7470A）携带SCCmecXIV元件，但该元件与典型SCCmecIII高度相似，差异在于其ccr基因复合体：经典SCCmecIII通常携带ccrA和ccrB基因，而7470A缺乏ccrA和ccrB，却携带ccrC。SCCmecII主要见于CC5和CC30菌株，SCCmecIVj元件在两国所有CC22菌株中被检测到，CC8菌株中观察到多种SCCmec（III、IV、V）元件。
**3.5 ST8和ST22菌株的系统基因组学背景**
本研究所有ST8菌株属于USA300谱系。来自南非的8227菌株聚集在典型USA300分支内，与USA300参考菌株FPR3757关系最近。所有ST22菌株属于EMRSA-15谱系。七株ST22菌株中的五株（来自南非）彼此亲缘关系更近，与来自德国的两株菌株距离较远。
**3.6 质粒分析**
基于MOBSCAN，mupA阳性质粒分为两个主要质粒组。第一组主要归属于rep_cluster_1142和rep_cluster_1142/rep_cluster_1281，携带松弛酶（MOBQ）基因和交配对形成系统（MPF_T），均为接合性质粒，属于pSK41/pGO1家族和rep15家族。第二组通常归类为rep_cluster_1017、rep_cluster_1215和rep_cluster_2214，携带动员蛋白V（MOBV）基因，多为可动员质粒，主要来自南非CC22-MRSA。使用Pling将mupA携带质粒分为两个主要质粒群落和两个单例质粒。第一群落包含六个共携带至少一种氨基糖苷类耐药基因（aac(6')-Ie/aph(2'')-Ia或aadD1）的质粒，除两个质粒中的qacC外，生物杀灭剂和重金属耐药基因基本缺失，这些接合质粒在德国占主导。第二群落包含七个mupA质粒，携带更广泛的生物杀灭剂/重金属耐药（arsR、arsB、arsC、cadD、mco、qacA）和β-内酰胺耐药（blaI、blaR1、blaZ）基因，主要为可动员质粒，主要来自南非血液培养物中的CC22-MRSA。来自南非ST8菌株（8227）的mupA质粒与先前报道的USA300相关质粒在结构和聚类上高度相似。质粒分析还检测到三个德国mupA阳性MRSA中的qacC基因，以及所有南非CC22-MRSA中的mco基因。
**讨论与结论**
本研究揭示了南非和德国mupR-MRSA的多样种群结构和水平基因转移潜力。mupR-MRSA分布于多种克隆背景，耐药可能通过独立进化事件和水平基因转移（可能由携带mupA的质粒介导）产生。不同SCCmec类型（IIa、III、IVa、IVj和V）的检测支持多种进化起源的观点。所有CC22菌株均携带SCCmecIVj元件，反映了医院相关克隆的全球传播和洲际扩散。南非ST239-CC8菌株中发现的SCCmecIII样元件（含ccrC而非ccrA/ccrB）代表了谱系和ccr复合体的新组合，表明SCCmec元件在局部MRSA种群中的持续进化和重组。CC30-MRSA中tst基因以及重金属和铜耐药基因的共存引起了公共卫生关注。mupA质粒可分为四个不同群落，包括两个单例，表明存在多次独立获得事件而非单一质粒谱系的克隆传播。氨基糖苷类耐药基因丰富的群落完全由接合质粒组成，与多种MRSA序列类型相关；而富含β-内酰胺/生物杀灭剂基因的群落主要由可动员质粒组成，与南非CC22-MRSA密切相关。质粒的区域性聚类以及抗生素、生物杀灭剂和金属耐药决定因素的共存，强调了局部抗菌药物和环境压力对质粒进化的潜在影响。研究局限性包括菌株收集和采样时期的差异可能不完全代表两国当前趋势。结论指出，mupR-MRSA在两个地理区域的不同克隆背景中出现，mupA质粒形成异质性基因库，按辅助基因含量、移动性和宿主关联组织成不同遗传群落。持续的基因组监测、抗菌药物使用和临床数据对于理解局部适应、追踪传播途径和指导针对mupR-MRSA谱系的感染控制策略至关重要。
该研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。
