《Acta Neuropathologica》：Cerebrospinal fluid cell-free DNA sequencing in pediatric CNS tumors: towards liquid molecular neuropathology
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儿童中枢神经系统肿瘤仍然是儿童癌症相关死亡的主要原因，而其诊断、风险分层和治疗管理越来越依赖于整合分子表征。然而，由于肿瘤位置、手术风险、有限的活检材料以及在疾病演变过程中重复取样不可行，代表性肿瘤组织常常难以获得。因此，脑脊液（CSF）已成为许多中枢神经系统
儿童中枢神经系统肿瘤仍然是儿童癌症相关死亡的主要原因，而其诊断、风险分层和治疗管理越来越依赖于整合分子表征。然而，由于肿瘤位置、手术风险、有限的活检材料以及在疾病演变过程中重复取样不可行，代表性肿瘤组织常常难以获得。因此，脑脊液（CSF）已成为许多中枢神经系统恶性肿瘤特别有信息量的液体活检隔室，富含肿瘤来源的游离DNA（cfDNA），并且对于与CSF空间接触的肿瘤，比血浆更直接地反映颅内肿瘤生物学；但其产量随肿瘤生物学和与CSF通路的解剖学接近程度而变化。在此，研究人员综述了支持CSF cfDNA测序作为儿童中枢神经系统肿瘤分子神经病理学新兴扩展的证据。靶向下一代测序（targeted NGS）、低深度全基因组测序（LP-WGS）、基于甲基化的分类器（methylation-based classifiers）和纳米孔测序（nanopore sequencing）现在能够从低输入的儿童CSF样本中对体细胞突变、拷贝数改变（CNAs）、表观遗传肿瘤类别和纵向肿瘤负荷进行互补评估。最近的研究已将该领域从分析概念验证推进到明确的临床场景，包括在活检不可行时的分子诊断、高CSF脱落肿瘤的分子分期、髓母细胞瘤和其他胚胎肿瘤的微小残留病（MRD）监测，以及模糊放射学进展的澄清。基于CSF的测序并不取代组织神经病理学，而是提供了一种液体分子层，可以补充、扩展或在特定情况下部分替代基于组织的诊断。其更广泛的应用现在依赖于工作流程标准化、检测特异性报告标准、外部质量保证（EQA）以及CSF指导的决策改善患者结局的前瞻性证据。
引言（Introduction）：儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童癌症死亡的主要原因，2021年世界卫生组织（WHO）分类已将诊断范式转向整合分子表征。CSF因直接接触肿瘤微环境而成为信息丰富的生物液体，富含肿瘤来源的循环肿瘤DNA（ctDNA），在接触CSF空间的肿瘤中比血浆更直接反映颅内生物学。研究人员回顾了支持CSF cfDNA测序作为分子神经病理学扩展的证据，并指出其临床成熟度分为三个层次：临床信息性（可靠提供分子信息）、临床可操作性（指导管理决策）和结局改善性（前瞻性显示改善患者结局）。当前CSF-NGS（基于CSF的下一代测序）在四个场景中具有临床信息性：活检不可行时的分子诊断、高CSF脱落肿瘤的初始分子分期、连续MRD监测以及真性进展与假性进展的鉴别。
CSF cfDNA分析的分子技术（Molecular technologies for CSF cfDNA analysis）：多种分子技术可应用于儿童CSF cfDNA，各具权衡。靶向测序面板（Targeted sequencing panels）基于扩增子或杂交捕获化学，可检测单核苷酸变异（SNVs）、插入/缺失、拷贝数变异（CNVs）和结构重排，变异等位基因频率（VAF）低至0.5%。低深度全基因组测序（Low-pass whole-genome sequencing, LP-WGS）提供全基因组拷贝数谱，尤其适用于具有特征性染色体改变（如17q等臂染色体、6号染色体单体、MYCN扩增）的胚胎肿瘤，用于MRD评估。新兴方法包括甲基化分析和纳米孔测序（Emerging approaches: methylation profiling and nanopore sequencing）：全基因组亚硫酸氢盐测序、简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）和免疫沉淀法（如cfMeDIP-seq）可从CSF cfDNA进行甲基化分类，与WHO 2021框架对齐；M-PACT深度神经网络可在单次运行中并行提供肿瘤分类、拷贝数谱和肿瘤微环境组成。纳米孔测序可实现实时、单次运行的甲基化分类和突变检测，周转时间可缩短至一天内。基于PCR的方法（PCR-based approaches as complements to NGS）如数字液滴PCR（ddPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）提供高灵敏度监测，用于已知驱动改变的绝对定量，如H3F3A K27M和BRAF V600E，以及生殖细胞肿瘤的miRNA。
分析前和分析考虑因素（Pre-analytical and analytical considerations）：CSF采集途径（腰椎穿刺、Ommaya储液囊或EVD）影响ctDNA浓度，应选择接近肿瘤的部位。血液污染会稀释肿瘤信号，需使用低吸附聚丙烯管并小心操作以减少创伤性穿刺。CSF体积小至200 μL可用于靶向测序，但1–3 mL可提高产量。cfDNA在1–2小时内迅速降解，需使用专用稳定管或立即离心处理。提取和文库制备需优化用于低输入cfDNA，推荐使用唯一分子标识符（UMIs）以增强低VAF变异的可靠检测。分析验证和质量控制包括文库复杂度、重复率、肿瘤分数估计（如ichorCNA）和噪声阈值；LP-WGS的CNV检测阈值约为3–10%肿瘤分数，取决于测序深度和分析方法。阴性结果需仔细解释，区分真阴性（肿瘤不脱落）和技术失败。向标准化（Toward standardization）方面，目前缺乏国际共识，多中心标准化和外部质量保证计划是当务之急。
临床应用（Clinical applications）：CSF-NGS效用因肿瘤类型而异。胚胎肿瘤（Embryonal tumors: medulloblastoma, ATRT, and ETMR）是最强适应症，因倾向于软脑膜播散并有可识别的CNVs。在初始分期中，LP-WGS检测肿瘤衍生CNVs的检出率为80–100%，远高于细胞学的11–20%。拷贝数谱可同时识别预后相关改变，如17q等臂染色体、6号染色体单体、MYCN扩增，并可推断亚组定义细胞遗传学模式。甲基化分类可从CSF cfDNA递归亚组分配。髓母细胞瘤是MRD监测最验证的适应症，前瞻性研究显示基线MRD阳性率在转移性疾病中达85%，持续阳性预测进展，分子检测比影像学复发提前约3个月。对于非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤（ATRT），诊断依赖于SMARCB1双等位基因失活，甲基化分析可解析三个分子亚组。对于伴多层菊形团的胚胎肿瘤（ETMR），miR-517a的RT-PCR可作为补充标志物。弥漫性中线胶质瘤、脑干胶质瘤和相关H3K27me3缺失肿瘤（Diffuse midline gliomas, brainstem gliomas, and related H3K27me3-loss tumors）代表最高活检风险场景，CSF-NGS在未活检患者中实现60–64%的分子诊断，在活检病例中达90%。除H3K27M突变外，WHO 2021还识别EZHIP过表达作为替代机制，可通过CSF甲基化分析捕获。另一个适应症是真性进展与假性进展的鉴别，通过连续H3K27M VAF追踪可预测治疗反应并解决模糊影像。高级别和低级别幕上胶质瘤（High-grade and low-grade supratentorial gliomas）显示异质性，高级别胶质瘤检出率84%，低级别50%，与脑室系统接近度和播散性疾病相关。CSF甲基化分类有助于区分真复发与继发恶性肿瘤。纵向CSF采样可捕获克隆进化，识别治疗压力下的新兴耐药突变。CSF-NGS可检测可操作改变（BRAF V600E、NTRK融合、FGFR改变），当组织不可用时支持精准医学试验资格。比较性能（Comparative performance: CSF versus cytology and plasma）：CSF-NGS在胚胎肿瘤中比细胞学有4–9倍优势，且在62%细胞学阴性样本中检测到CNVs。CSF优于血浆，在匹配样本中检出率89%对比4%，但血浆在血脑屏障破坏时可能互补，如BRAF V600E的检测。
将CSF-NGS整合到临床实践（Integrating CSF-NGS into clinical practice）：研究人员提出四个证据分级的临床适应症：分子诊断（活检不可行，证据等级3）、初始分子分期（高CSF脱落肿瘤，等级2）、连续MRD监测（等级2）和真性进展与假性进展鉴别（等级3）。另有一个横向作用：跨实体识别可操作改变。多学科工作流程（Multidisciplinary workflow）明确神经肿瘤学家、神经外科医生、分子病理学实验室的角色，CSF采样应方便地结合常规腰椎穿刺，MRD监测应前瞻性嵌入治疗方案。结果需在肿瘤委员会审议，报告应包含样本充分性、肿瘤分数估计和检测限。监管、基础设施和经济障碍（Regulatory, infrastructural, and economic barriers）包括CSF-NGS作为实验室开发测试（LDT）的监管不确定性、缺乏成本效益分析和专用报销途径，以及集中的生物信息学能力。
局限性和未来方向（Limitations and future directions）：当前局限性（Current limitations）包括缺乏前瞻性干预试验、发表偏倚（高脱落肿瘤占主导）、生物学天花板（低脱落肿瘤检出率约50%）、超灵敏假阳性风险、缺乏标准化工作流程以及伦理实施问题（如MRD阳性但无有效治疗方案）。未来方向（Future directions）包括多组学整合（突变、甲基化、蛋白质组）、人工智能增强诊断、片段组学分析（如基于片段长度分布的分类）、纳米孔测序实现当天诊断、国际共识倡议以及前瞻性临床试验将CSF-NGS作为分子资格标准或MRD指导治疗分层终点。
结论（Conclusion）：基于CSF的NGS已超越分析概念验证，在选定的儿童CNS肿瘤场景中具有临床信息性。标准化和干预性获益证据是广泛采用的关键。研究人员提出四项建议：整合CSF-NGS到四个适应症路径；多中心标准化工作流程；按肿瘤类型分层发布真实世界性能基准和临床可操作的MRD阈值；将实时CSF ctDNA动力学的适应性设计试验纳入下一代国际儿科脑肿瘤方案。
