《Phytopathology Research》：An AP-GPCR bigram in Phytophthora capsici is essential for virulence and potentially participates in virulence-related signaling pathways
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天冬氨酸蛋白酶（APs）和G蛋白偶联受体（GPCRs）在真核生物中广泛存在，并在多种细胞过程中发挥重要作用，包括蛋白质修饰和细胞信号传导。在卵菌中，这两个功能蛋白结构域融合成一个单一蛋白，形成所谓的双结构域蛋白（bigram）。然而，这些AP-GPCR双结构域
天冬氨酸蛋白酶（APs）和G蛋白偶联受体（GPCRs）在真核生物中广泛存在，并在多种细胞过程中发挥重要作用，包括蛋白质修饰和细胞信号传导。在卵菌中，这两个功能蛋白结构域融合成一个单一蛋白，形成所谓的双结构域蛋白（bigram）。然而，这些AP-GPCR双结构域蛋白的功能在很大程度上仍未知。本研究聚焦于毁灭性卵菌植物病原体辣椒疫霉（Phytophthora capsici）中的一个AP-GPCR双结构域蛋白，该蛋白由单拷贝基因编码。生物信息学分析确认，PcAPG编码一个膜相关蛋白，具有N端信号肽、中央AP结构域和C端七次跨膜GPCR结构域。表达谱分析揭示，PcAPG组成型表达，在宿主感染早期（1.5—12小时接种后，hpi）显著上调。使用改良的CRISPR/Cas9系统敲除PcAPG导致突变体仅出现轻微菌丝生长缺陷，但毒力严重减弱，表明PcAPG在植物-病原体相互作用中起关键作用。野生型菌株与代表性突变体之间的比较转录组分析提示，PcAPG可能通过GPCR介导的信号通路参与调控一组假定感染相关基因的表达。值得注意的是，在野生型菌株中，涉及分解代谢过程的158个基因（如多糖降解和水解酶活性，例如α-半乳糖苷酶活性和阿拉伯聚糖分解代谢过程）在感染期间上调，而在突变体中这些基因未上调。基于研究人员的发现得出结论：AP-GPCR双结构域蛋白PcAPG是辣椒疫霉的一个关键毒力因子，可能在多种分解代谢酶的下游转录激活中发挥作用，从而促进宿主定殖和入侵。这项工作揭示了卵菌病原体中一个独特的信号模块——AP-GPCR双结构域蛋白，并确定PcAPG是针对疫霉引起疾病的新型防控策略的一个有前景的潜在靶标。
天冬氨酸蛋白酶（APs）和G蛋白偶联受体（GPCRs）是真核生物中重要的蛋白质家族，在蛋白质修饰和细胞信号传导中发挥关键作用。卵菌中，这两个功能域融合成单一蛋白，形成AP-GPCR双结构域蛋白（bigram），但其功能尚不明确。辣椒疫霉（Phytophthora capsici）是一种毁灭性卵菌植物病原体，感染多种作物造成巨大经济损失，当前杀菌剂抗性日益严重，亟需新防控策略。研究人员聚焦于辣椒疫霉中一个保守的AP-GPCR双结构域蛋白编码基因PcAPG，通过生物信息学分析、表达谱分析、改良CRISPR/Cas9基因敲除、转录组测序（RNA-seq）和功能验证，探究其生物学功能。研究发表在《Phytopathology Research》。
主要关键技术方法包括：利用SMART、TMHMM、SignalP、AlphaFold3等工具进行生物信息学分析和3D结构预测；通过RT-qPCR检测PcAPG在不同发育阶段（菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢）和感染阶段（接种辣椒叶片后1.5、3、6、12、24、48小时）的表达模式；采用改良CRISPR/Cas9系统，将sgRNA表达质粒、Cas9表达质粒和同源重组模板（含eGFP）共转化辣椒疫霉菌株BYA5原生质体，经杀菌剂oxathiapiprolin筛选获得纯合敲除突变体；对突变体和野生型菌株进行生物学特性比较（菌落直径、孢子囊产量、游动孢子产量、休止孢萌发率）；毒力测定采用菌丝块和游动孢子接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）和辣椒叶片；转录组分析对野生型和突变体在培养基和接种辣椒叶片12小时后的菌丝进行RNA-seq（Illumina NovaSeq平台），使用HISAT2比对、StringTie组装、DESeq2进行差异表达分析（|Log2FC|≥1，FDR<0.05），并利用GO富集分析功能。
**基因模型校正与生物信息学分析**：通过基因组比对和PCR扩增获得全长PcAPG基因，编码748个氨基酸，含N端信号肽、中央AP结构域和C端七次跨膜GPCR结构域。系统发育分析显示AP-GPCR双结构域蛋白在卵菌中保守。
**PcAPG在不同生活阶段的表达谱**：RT-qPCR显示PcAPG在辣椒疫霉无性生命周期各阶段（菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢）均表达，菌丝阶段表达最高；感染早期（1.5—12小时接种后）表达显著上调。
**CRISPR系统敲除PcAPG**：通过改良CRISPR/Cas9系统成功获得三个纯合敲除突变体，表明PcAPG非生存必需基因。
**PcAPG敲除突变体的生物学特性**：突变体菌丝生长速度略慢于野生型，但菌落形态、孢子囊产量、游动孢子产量和休止孢萌发率与野生型无显著差异。
**PcAPG敲除突变体的毒力**：用菌丝块和游动孢子接种本氏烟和辣椒叶片，突变体引起的病斑面积显著小于野生型，表明PcAPG对毒力至关重要。
**敲除突变体与野生型的转录组分析**：RNA-seq显示，野生型和突变体在接触植物后均发生转录重编程，但突变体中差异表达基因更多，而野生型中基因表达变化幅度更大。野生型在感染期间有158个基因特异性上调，这些基因主要富集于分解代谢过程，如α-半乳糖苷酶活性、氧化还原酶活性、多糖分解代谢、阿拉伯聚糖代谢等。
**PcAPG潜在调控基因的功能分析**：GO富集分析揭示158个基因参与多种分解代谢活动，包括多糖降解和水解酶活性，这些可能在宿主定殖中发挥作用。RT-qPCR验证了10个基因的表达趋势，证实转录组数据可靠。
**讨论与结论**：PcAPG的缺失对基础发育影响小但严重削弱毒力，表明其功能特异于宿主-病原体互作。PcAPG可能通过GPCR结构域感知宿主信号，激活下游分解代谢酶基因表达，促进组织定殖和营养获取。AP结构域可能参与蛋白加工，但具体机制待研究。结论：本研究鉴定并表征了辣椒疫霉中一个保守的AP-GPCR双结构域蛋白作为关键毒力决定因子。PcAPG缺失对基本生长发育影响甚微，但显著降低对植物的毒力。研究人员提出其功能与调控多个感染相关分解代谢基因有关，可能通过一条新信号通路实现。这项工作不仅加深了对卵菌生物学和致病机制的理解，还突出了这些病原体中可能用于未来作物保护的独特分子机制。
