携带cry1Ab和vip3Aa Bt基因的转基因甘蔗用于管理甘蔗螟虫（Diatraea saccharalis）

《Frontiers in Plant Science》：Transgenic sugarcane harboring cry1Ab and vip3Aa Bt genes for the management of Diatraea saccharalis

　　

甘蔗螟虫（Diatraea saccharalis）是美洲甘蔗的主要害虫，造成显著的产量和品质损失。利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）基因进行遗传转化是综合害虫管理（integrated pest management）的有效策略。在本研究中，研究人员通过微弹轰击法将cry1Ab和vip3Aa基因共同导入商业甘蔗品种TUC 03–12的胚性愈伤组织中，以产生基因聚合（pyramided）的Bt事件。通过聚合酶链式反应（PCR）确认转基因整合，有247个再生株系至少对一个转基因呈阳性。基于轰击的胚性愈伤组织总数，总转化效率为6.24%。使用侧流免疫层析测定（lateral flow immunoassay）进行的蛋白表达筛选显示，76.6%的PCR阳性株系表达了可检测的Cry1Ab蛋白，而Vip3Aa蛋白在33.3%的双阳性株系中被检测到。在受控条件下的表型生物测定显示，D. saccharalis幼虫死亡率很高，在几个表达两种蛋白的转基因株系中超过80%。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量Cry1Ab蛋白，揭示了不同株系间的变异性，并支持了蛋白积累对昆虫抗性的功能相关性。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析显示，与未转化的植物相比，cry1Ab和vip3Aa转录本水平分别增加了3–140倍和2–1400倍。在cry1Ab转录本水平和蛋白积累之间观察到强正相关，表明转录活性是毒素水平的主要决定因素。这些结果表明，在受控条件下，几个转基因株系表现出对D. saccharalis增强的抗性，包括同时表达Cry1Ab和Vip3Aa蛋白的株系。这些发现支持了基因聚合Bt甘蔗作为D. saccharalis管理的一种有前景的策略的潜力。

**论文解读：转基因甘蔗聚合cry1Ab与vip3Aa Bt基因用于防治甘蔗螟虫（Diatraea saccharalis）**

**研究背景与问题**
甘蔗螟虫（Diatraea saccharalis）是美洲甘蔗产区最具破坏性的害虫之一，幼虫取食叶片并钻蛀茎秆，破坏维管系统，同时为真菌和细菌入侵提供通道，导致红腐病复合症，降低蔗糖和乙醇产量。传统防治方法（如农艺措施、生物防治和化学杀虫剂）控制效果有限，且存在环境与经济成本。利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）基因进行遗传转化，因其高特异性和对非靶标生物的安全性，成为害虫综合管理的有效工具。Bt产生的Cry蛋白（孢子形成期）和Vip蛋白（营养期）作用于幼虫中肠但结合不同受体，两者结构差异和独立结合位点降低了交叉抗性风险，支持基因聚合（pyramiding）策略。然而，Vip蛋白在甘蔗这类复杂多倍体作物中的表达稳定性、蛋白积累及抗虫贡献研究不足；甘蔗品种（如TUC 03-12）基因组高度多倍体和非整倍体，基因组冗余大，导致转基因表达因位置效应、拷贝数变异、表观修饰和基因沉默机制而变异性大。此外，田间已报道靶标害虫对多种Cry蛋白产生抗性，而目前商业Bt甘蔗（如巴西的CTC20BT、CTC9001BT等）仅表达单一Cry蛋白，尚无聚合Bt基因的品种上市。因此，研究人员开展本研究，旨在通过微弹轰击法将cry1Ab和vip3Aa基因聚合导入阿根廷商业品种TUC 03-12，评估转基因事件整合、表达及对D. saccharalis的抗性，为下一代抗虫品种开发提供依据。论文发表在《Frontiers in Plant Science》。

**关键技术方法**
研究人员采用微弹轰击法将三个质粒（携带cry1Ab基因、vip3Aa基因和nptII选择标记基因）共转化至商业甘蔗品种TUC 03-12（由阿根廷Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres, EEAOC开发）的胚性愈伤组织。通过PCR筛选转基因阳性株系，利用侧流免疫层析测定（lateral flow immunoassay）检测Cry1Ab和Vip3Aa蛋白表达，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量Cry1Ab蛋白积累，使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析cry1Ab和vip3Aa转录本水平。抗虫性评估在受控条件下进行，使用D. saccharalis初孵幼虫（L1期）进行叶片生物测定，幼虫来源为2025年1月采集于阿根廷Tucumán省Overo Pozo County（S: 26° 50′ 4.4′′, W: 64° 52′ 8′′）田间种群，在实验室饲养多代后用于试验。

**研究结果**
**3.1 转化、选择与转基因事件的分子检测**
从3960个轰击的胚性愈伤组织中获得374个遗传霉素抗性株系，经PCR检测，247个为阳性（至少含一个转基因），其中229个仅含cry1Ab，18个同时含cry1Ab和vip3Aa，总转化效率为6.24%。未检测到仅含vip3Aa的株系。171个PCR阳性株系成功生根并驯化，用于后续蛋白检测和表型分析，其中9个聚合株系（cry1Ab + vip3Aa）为L30、L113、L114、L157、L177、L294、L357、L440和L573。

**3.2 侧流免疫层析检测Cry1Ab和Vip3Aa蛋白**
在171个PCR阳性株系中，131个（76.60%）检测到Cry1Ab蛋白；在9个聚合株系中，3个（L114、L157和L294，占33.3%）同时检测到Cry1Ab和Vip3Aa蛋白。

**3.3 受控条件下对D. saccharalis的表型测定**
初始筛选评估134个转基因株系，基于校正死亡率将60个归入最高抗性组（Group A）。从中选取18个不同转基因组合且表型与亲本TUC 03-12相似的株系进行二次评估，其中16个株系（包括两个聚合事件L157和L294）幼虫死亡率达83%–98%（Group A），L114和L30死亡率约65%–70%（Group B），非转基因再生对照（L22）死亡率仅为2.89%（Group C）。Bt玉米阳性对照死亡率为96.78%，证实试验系统可靠性。

**3.4 甘蔗株系中Cry1Ab蛋白积累**
ELISA定量显示，Cry1Ab蛋白积累量在独立株系间变异显著。Bt玉米对照含量最高（>1400 ng g^-1鲜重），转基因株系中L47和L294积累最高（约450–500 ng g^-1鲜重），L434、L133和L410最低（<100 ng g^-1鲜重），非转基因对照几乎无检测信号。

**3.5 转基因表达RT-qPCR分析**
对6个聚合株系进行RT-qPCR分析，L294的cry1Ab转录本相对表达量最高（143.09倍），vip3Aa表达量为313.63倍；其余株系cry1Ab表达范围为3–34倍，vip3Aa表达范围为2–1443.9倍（L114最高）。cry1Ab转录水平与Cry1Ab蛋白积累呈显著正相关（Pearson r = 0.83, p = 0.04），表明转录活性是蛋白水平的主要决定因素。

**讨论与结论**
讨论部分指出，甘蔗遗传转化效率受基因型影响大，本研究中cry1Ab阳性事件频率高于vip3Aa事件，可能源于共转化效率差异或构建体大小。Vip3Aa蛋白检测率低可能与转录后调控、蛋白稳定性或侧流免疫层析灵敏度有关。表型测定显示多数转基因株系幼虫死亡率显著高于对照，部分单cry1Ab事件与聚合事件抗性相当，但聚合策略仍对延缓抗性进化重要，因Cry和Vip蛋白作用受体不同。ELISA揭示Cry1Ab积累变异大，但表型反应范围窄，可能限制了强关联的检测。RT-qPCR证实Zm-Ubi1启动子驱动下转录本积累整体较高，且cry1Ab转录与蛋白积累正相关。Vip3Aa表达更受限，仅三个聚合株系（L114、L157、L294）同时具备较高转录和可检测蛋白。

**研究结论**：
本研究证明了生成携带cry1Ab和vip3Aa基因的转基因甘蔗事件的可行性，并实现了功能性Bt基因表达及对D. saccharalis的杀虫活性。Cry1Ab构建体在大多数株系中表现一致，而Vip3Aa表达更受限和可变，表明需进一步优化聚合构建体和表达策略。目前商业Bt甘蔗主要依赖单一Cry蛋白，可能增加田间抗性进化风险。在此背景下，开发聚合Cry1Ab–Vip3Aa甘蔗代表了一种可能增强抗虫持久性并支持更可持续害虫管理的有前景的方法，尽管这需要田间条件验证。最有利的事件目前正在营养繁殖以产生足够材料用于未来田间试验，这些评估还应包括抗性管理和环境生物安全，如对非靶标生物、基因流和甘蔗农业生态系统生态交互的影响。全面的风险评估和监管评估对于Bt甘蔗事件潜在商业部署至关重要。