黏膜相关恒定T细胞在内脏利什曼病与HIV合并感染中的表型特征

《Frontiers in Immunology》：Phenotypic characterization of mucosal-associated invariant T cells in visceral leishmaniasis and HIV co-infection

　　

摘要引言：黏膜相关恒定T细胞（MAIT）是一种具有先天样抗菌反应能力的非传统T淋巴细胞。尽管它们在细菌和病毒感染中的作用已得到公认，但它们在原生动物疾病，尤其是内脏利什曼病（VL）和HIV合并感染中的参与仍知之甚少。方法：一项横断面研究评估了内脏利什曼病患者（VL，n=8）、VL-HIV合并感染患者（VL-HIV，n=10）、接受脂质体两性霉素B预防性治疗的VL-HIV合并感染患者（VL-HIV(T)，n=9），以及由HIV单独感染（HIV，n=11）和未感染（NI，n=11）个体组成的参考组中循环MAIT细胞的免疫表型特征。多参数流式细胞术评估了MAIT细胞频率、亚群分布（CD4⁺、CD8⁺和CD4^?CD8^?），以及活化、共刺激、细胞毒性、耗竭和记忆标志物的表达。进行了整合相关性网络分析以评估MAIT细胞标志物之间的免疫学相互作用。结果：在VL和VL-HIV患者中，MAIT细胞频率显著降低，主要影响CD8⁺亚群。倍数变化分析表明，VL和VL-HIV患者中活化及细胞毒性特征增强，CD69、CD38、NKG2D和CD107A显著上调，同时抑制性受体（PD-1、TIM-3、LAG-3）表达增加，尤其在CD8⁺和CD4^?CD8^? MAIT细胞中。相比之下，VL-HIV(T)患者表现出这种过度活化/耗竭表型的下降以及中央记忆相关特征的部分恢复，提示治疗下免疫重新平衡。整合相关性网络分析揭示了MAIT细胞免疫相互作用的显著差异。VL和VL-HIV组显示网络密度降低、选择性轴连接性下降，以及活化、细胞毒性和记忆节点间相互作用的碎片化，这与免疫紊乱一致。相反，接受治疗的VL-HIV(T)患者表现出连接性增加以及功能标志物之间协调相互作用的重建，表明MAIT细胞免疫网络架构的部分重建。讨论：总之，VL和VL-HIV合并感染与循环MAIT细胞的定量消耗和定性失调相关，其特点为同时存在的过度活化和耗竭，加之免疫网络碎片化，而脂质体两性霉素B治疗似乎促进了部分免疫重组。

**论文解读：内脏利什曼病与HIV合并感染中黏膜相关恒定T细胞的表型特征**

**研究背景与现存问题**
内脏利什曼病（VL）是由利什曼原虫（Leishmania donovani复合体，巴西主要为Leishmania infantum）引起的最严重的利什曼病类型，因其高发病率和死亡率成为全球健康挑战。近年来，尽管VL发病率趋于稳定，但病死率却因诊断延迟、治疗局限、传播媒介地理扩张以及HIV合并感染的出现而上升。在巴西，约19%的VL病例发生在HIV感染者中，其死亡率显著升高。VL-HIV合并感染存在双向致病相互作用：HIV介导的免疫抑制增加对利什曼原虫的易感性并加速疾病进展，而寄生虫诱导的慢性免疫激活则增强HIV复制，形成自我强化的恶性循环，加剧疾病严重程度并复杂化临床管理。

黏膜相关恒定T细胞（MAIT）是一类非传统T淋巴细胞，具有先天样抗菌反应能力，通过半不变αβT细胞受体识别核黄素衍生的微生物代谢产物，受单态性MR1分子限制，高度富集于外周血和屏障组织（尤其是肝脏），是抗菌免疫的关键哨兵。既往研究表明，VL和HIV感染均能独立破坏MAIT细胞稳态：VL导致MAIT细胞频率降低、活化增强及效应功能受损，与疾病严重程度相关；HIV则引起早期、持续的MAIT细胞耗竭，伴活化及功能耗竭，抗逆转录病毒治疗（ART）仅能部分纠正。然而，VL-HIV合并感染对MAIT细胞生物学的影响尚不清楚。因此，开展这项研究旨在阐明VL-HIV合并感染背景下MAIT细胞的表型与功能景观，为理解合并感染的免疫发病机制及识别潜在免疫治疗靶点提供依据。该研究论文发表于《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术与方法**
研究人员在巴西贝洛奥里藏特的René Rachou研究所（Fiocruz-Minas）和Eduardo de Menezes医院开展了一项横断面研究。样本队列来源包括：VL患者（n=8）、VL-HIV合并感染患者（VL-HIV，n=10）、接受脂质体两性霉素B预防性治疗的VL-HIV患者（VL-HIV(T)，n=9），以及HIV单独感染（HIV，n=11）和未感染（NI，n=11）的参考组。主要关键技术是多参数流式细胞术，用于评估MAIT细胞频率、亚群分布（CD4⁺、CD8⁺和CD4^?CD8^?），以及活化/共刺激（CD69、CD38、CD28、ICOS）、细胞毒性（CD107A、NKG2D）、耗竭（TIM-3、PD-1、LAG-3）和记忆（CD62L、CD45RO、CD27）标志物的表达。此外，采用Spearman相关性检验构建整合相关性网络，分析MAIT细胞标志物之间的免疫学相互作用，仅纳入中等到强相关（|r|>0.67，p<0.05），并使用Cytoscape软件进行网络可视化。

**研究结果**

**3.1 循环MAIT细胞亚群的整体特征**
通过流式细胞术分析，研究人员发现VL和VL-HIV患者的总MAIT细胞频率（CD3⁺ TCRVα7.2⁺ CD161⁺）相较于未感染个体显著降低，而VL-HIV(T)组则无显著差异。亚群分布显示，VL患者中CD4⁺ MAIT细胞相对增加，CD8⁺ MAIT细胞频率降低；VL-HIV合并感染患者中，CD4⁺ MAIT细胞较HIV单独感染组减少，CD8⁺ MAIT细胞较NI组减少；所有VL组（VL、VL-HIV、VL-HIV(T)）中CD4^?CD8^? MAIT细胞频率均较HIV组升高。

**3.2 MAIT细胞亚群的活化/共刺激及细胞毒性表型**
活化标志物CD69和CD38在VL和VL-HIV患者的MAIT细胞亚群中表达升高（以整合平均荧光强度iMFI表示）。VL患者的CD8⁺ MAIT细胞中CD69表达高于VL-HIV和VL-HIV(T)组；VL-HIV患者的CD8⁺ MAIT细胞中CD38表达高于VL组，且VL和VL-HIV组CD4^?CD8^? MAIT细胞中CD38水平高于VL-HIV(T)组。共刺激分子CD28在VL和VL-HIV患者的CD4⁺ MAIT细胞中表达升高，且两组均高于VL-HIV(T)组；ICOS在VL-HIV患者的所有三个MAIT亚群中表达显著升高，且高于VL-HIV(T)组。细胞毒性标志物CD107A在VL-HIV患者的CD4⁺和CD4^?CD8^? MAIT细胞中表达升高，且CD4⁺亚群中VL-HIV组高于VL组；NKG2D在VL和VL-HIV患者的CD4^?CD8^? MAIT细胞中表达升高。

**3.3 MAIT细胞亚群的耗竭特征**
抑制性受体TIM-3、PD-1和LAG-3的表达在VL和VL-HIV患者的MAIT细胞中普遍升高。TIM-3在VL和VL-HIV患者的CD4⁺ MAIT细胞中表达升高，且高于VL-HIV(T)组；在CD4^?CD8^? MAIT细胞中，VL组高于NI组和VL-HIV(T)组。PD-1在VL-HIV患者的CD4⁺ MAIT细胞中表达升高；在CD4^?CD8^? MAIT细胞中，VL组高于HIV组和VL-HIV(T)组。LAG-3在VL和VL-HIV患者的CD4⁺ MAIT细胞中表达升高，且VL-HIV组高于NI组；在CD8⁺ MAIT细胞中，VL和VL-HIV组均高于VL-HIV(T)组。

**3.4 MAIT细胞记忆特征**
基于CD45RO、CD27和CD62L的表达，研究人员分析了CD8⁺和CD4^?CD8^? MAIT细胞中的记忆亚群（初始、中央记忆、效应记忆、早期效应）。VL-HIV患者的初始CD8⁺ MAIT细胞频率高于HIV组；VL-HIV(T)患者的早期效应CD4^?CD8^? MAIT细胞频率高于VL组；VL-HIV和VL-HIV(T)组的早期效应CD4^?CD8^? MAIT细胞频率均高于NI组。中央记忆和效应记忆亚群未见显著差异。

**3.5 表型改变的幅度**
倍数变化（FC）分析量化了各组间MAIT细胞亚群中表型标志物表达的变化幅度。VL/NI比较显示，总MAIT细胞（0.2倍）和CD8⁺ MAIT细胞（0.7倍）频率降低，而CD4⁺ MAIT细胞（2.3倍）频率升高；活化标志物CD69、CD38及耗竭标志物TIM-3、LAG-3等显著上调（FC最高达19.4倍）。VL/VL-HIV比较显示，VL-HIV组中ICOS、CD107A和LAG-3等标志物表达更高。VL-HIV(T)与VL比较显示，VL-HIV(T)组中CD28、ICOS、TIM-3等表达升高，而效应记忆细胞减少。VL-HIV/VL-HIV(T)比较显示，VL-HIV(T)组中总MAIT细胞频率升高（2.6倍），而多种活化及耗竭标志物表达降低。

**3.6 总网络与选择性轴网络**
使用Spearman相关性构建的整合网络分析显示，NI组总相关数最高（n=178），其次为HIV组（n=174）、VL-HIV(T)组（n=132）、VL-HIV组（n=88）和VL组（n=66）。选择性轴网络分析显示，NI和HIV组均具有120个选择性轴，VL-HIV(T)组为88个，VL-HIV组为59个，VL组为34个。VL和VL-HIV组表现出网络密度降低、连接性下降及相互作用碎片化，而VL-HIV(T)组则表现出部分恢复，连接性增加。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次提供了VL和VL-HIV合并感染背景下循环MAIT细胞的综合表型特征，证实了定量消耗与定性失调（包括过度活化与耗竭并存，以及免疫网络碎片化）的存在。这些发现扩展了单一感染背景下的观察，并建立了合并感染中MAIT细胞整合表型景观。研究表明，VL是MAIT细胞耗竭的主要驱动因素，而寄生虫相关炎症信号可能超过HIV单独感染的影响。VL-HIV(T)患者中耗竭标志物表达减弱，提示寄生虫控制足以部分逆转耗竭表型。网络分析揭示了免疫相互作用的系统性破坏，而治疗促进了部分恢复。研究局限性包括横断面设计、样本量较小（每组8-11例），以及基于CD3⁺TCRVα7.2⁺CD161⁺定义MAIT细胞可能因慢性活化导致CD161下调而低估频率。

**结论翻译**：本项研究首次对内脏利什曼病个体（根据HIV合并感染状态和脂质体两性霉素B治疗分层）中循环MAIT细胞进行了全面的表型特征描述。总体而言，研究人员的发现表明，VL和VL-HIV合并感染导致MAIT细胞的定量消耗和深刻的定性失调，其特征为同时存在的过度活化、耗竭和系统层面的网络碎片化。这些改变在未治疗的合并感染者中最为显著，反映了双重感染的协同免疫抑制负担。关键的是，脂质体两性霉素B治疗与MAIT细胞频率的部分恢复、过度活化/耗竭表型的减弱以及协调性免疫网络连接性的重建相关。总之，这些发现将MAIT细胞定位为免疫紊乱的敏感指标和VL-HIV合并感染中治疗反应的潜在生物标志物，对监测这一高风险人群的免疫改变具有重要意义。