《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Regulation of Caenorhabditis elegans avoidance behavior toward Pseudomonas aeruginosa PA14 by the canonical Wnt signaling pathway
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利用遗传和行为分析，研究人员确定了经典Wnt/β-catenin信号在调控秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌PA14回避行为中的作用。RNAi分析提示Wnt配体cwn-2可能参与其中，尽管cwn-2突变体表型的解读受到运动缺陷的限制。遗传和行为分析进一步表明受体cfz
利用遗传和行为分析，研究人员确定了经典Wnt/β-catenin信号在调控秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌PA14回避行为中的作用。RNAi分析提示Wnt配体cwn-2可能参与其中，尽管cwn-2突变体表型的解读受到运动缺陷的限制。遗传和行为分析进一步表明受体cfz-2、转导蛋白dsh-1和β-catenin同源物bar-1参与该行为，而gsk-3作为负调控因子发挥作用。上位性分析进一步支持cfz-2在回避调控中遗传上作用于gsk-3和bar-1的上游。报告基因分析显示cfz-2和dsh-1在头部区域具有神经元样形态的细胞亚群中重叠表达，支持Wnt通路表达与可能参与回避调控的细胞之间存在潜在关联。然而，这些数据并未确定神经元特异性的作用位点。系统水平分析进一步表明，通过Wnt通路筛选鉴定的基因与已知回避相关调控网络密切相关，并富集在神经元发育、受体介导的信号传导和细胞间通讯相关的通路中。总之，这些发现支持经典Wnt/β-catenin信号在PA14回避中的作用，并支持Wnt通路活性与回避相关细胞或调控网络之间的潜在关联。
**经典Wnt信号通路调控秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌PA14回避行为的遗传学解析**
**一、研究背景与目的**
秀丽隐杆线虫（*Caenorhabditis elegans*, C. elegans）凭借其302个神经元的简洁神经系统、高度遗传可操作性、光学透明性以及完整的连接组图谱，已成为神经环路与行为决策研究的核心模式生物。其丰富的先天性和经验依赖性行为，包括趋化、温度趋向、学习记忆和病原体回避，为定量解析行为决策的分子与神经机制提供了高度可控的平台。其中，利用条件致病菌铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa* PA14）建立的菌苔回避实验（lawn avoidance assay）是研究病原体感知与回避行为的经典范式。在该实验中，线虫被置于PA14菌苔上，回避行为表现为线虫离开中央菌苔并向周围无细菌区域移动，通过回避指数（avoidance index）进行定量评估。
在分子层面，已知p38 MAPK、TGF-β和胰岛素/PI3K等多条进化保守的信号通路协同调控PA14回避行为，神经肽受体npr-1通路作为核心枢纽，动态整合环境与内部信号以调节回路兴奋性。然而，Wnt信号通路——这一在胚胎发育、轴突导向、突触特异性和成年神经元转录重塑中发挥关键作用的保守细胞间通讯系统——是否参与成熟动物对病原体的实时回避行为，此前缺乏直接遗传学证据。经典Wnt/β-catenin通路中，配体（如cwn-2）与Frizzled家族受体（如cfz-2）结合，经Disheveled蛋白（如dsh-1）抑制gsk-3活性，导致β-catenin（如bar-1）稳定并核转位，与TCF/LEF转录因子结合激活靶基因转录。鉴于gsk-3同时处于Wnt信号与胰岛素/PI3K、p38等应激通路的交汇节点，研究人员提出假设：经典Wnt信号可能作为行为调控网络的新组分参与成年线虫的病原体回避。该研究发表于《Frontiers in Molecular Neuroscience》，旨在通过遗传筛选、行为学分析、报告基因定位和系统水平网络分析，系统阐明经典Wnt/β-catenin通路在PA14回避行为中的作用及其在调控网络中的遗传位置。
**二、主要技术方法**
研究人员综合运用了以下关键技术手段：1）RNAi喂食筛选结合qPCR验证，系统性敲低Wnt通路各组分基因；2）PA14菌苔回避实验定量评估回避行为，以8小时回避指数为核心指标，同时通过身体弯曲实验排除运动缺陷干扰，并通过体宽体长测量排除发育异常影响；3）利用多种突变体菌株（包括cfz-2(ok1201)、dsh-1(ok1445)、gsk-3(tm1237)、bar-1(mu63)等）进行遗传验证，并通过遗传杂交构建双突变体进行上位性分析；4）构建Pcfz-2::GFP和Pdsh-1::mCherry荧光报告基因，观察头部区域表达模式；5）利用STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析，使用clusterProfiler R包进行GO和KEGG富集分析。突变体菌株来源于线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）及日本国家生物资源项目（National BioResource Project）。
**三、研究结果**
**3.1 RNAi分析提示Wnt配体cwn-2可能参与PA14回避**
研究人员首先建立了PA14回避时间曲线，8小时被确定为标准检测时间点。RNAi敲低cwn-2显著降低回避指数（0.22 ± 0.07 vs 0.48 ± 0.09），且不影响基础运动能力和体型。然而，cwn-2(ok895)突变体表现出显著的运动缺陷（68 vs 113 bends/min），因此cwn-2突变体的回避表型不能直接归因于其特异性调控作用，需谨慎解读。
**3.2 Wnt受体cfz-2调控线虫对PA14的回避行为**
cfz-2 RNAi显著降低回避指数（0.07 ± 0.02 vs 0.40 ± 0.07），而mig-1 RNAi无显著效果。cfz-2(ok1201)突变体回避指数显著低于野生型（0.20 ± 0.03 vs 0.53 ± 0.09），且无运动或体型异常。内源启动子驱动的Pcfz-2::cfz-2回救实验完全恢复了突变体的回避缺陷（0.43 ± 0.04 vs 野生型0.42 ± 0.02），证实cfz-2特异性参与回避调控。
**3.3 Disheveled家族成员dsh-1调控线虫对PA14的回避行为**
dsh-1 RNAi显著降低回避指数（0.21 ± 0.10 vs 0.41 ± 0.07），而dsh-2 RNAi无显著效果；mig-5 RNAi虽降低回避指数但伴随运动缺陷，未进一步分析。dsh-1(ok1445)突变体回避指数显著低于野生型（0.24 ± 0.02 vs 0.44 ± 0.02），且无运动或体型异常，支持dsh-1的特异性作用。
**3.4 gsk-3负调控线虫对铜绿假单胞菌PA14的回避行为**
gsk-3 RNAi显著升高回避指数（0.54 ± 0.02 vs 0.35 ± 0.02）。gsk-3(tm1237)突变体回避指数显著高于野生型（0.59 ± 0.02 vs 0.40 ± 0.03）。在gsk-3(tm1237); cfz-2(ok1201)双突变体中，回避表型与gsk-3单突变体相似（0.72 vs 0.73），表明gsk-3在遗传上位于cfz-2下游，符合经典Wnt信号逻辑。
**3.5 β-catenin同源物bar-1在gsk-3下游促进PA14回避**
在bar-1、sys-1、wrm-1三个β-catenin相关基因中，仅bar-1 RNAi显著降低回避指数（0.12 ± 0.02 vs 0.32 ± 0.02）。bar-1(mu63)突变体回避指数显著低于野生型（0.21 ± 0.02 vs 0.68 ± 0.02），Pbar-1::bar-1回救完全恢复回避表型（0.50 ± 0.03 vs 野生型0.46 ± 0.03）。gsk-3(tm1237); bar-1(mu63)双突变体表型与bar-1单突变体相似（0.18 vs 0.21），表明bar-1位于gsk-3下游。此外，lrp-1、apr-1、mom-1、kin-19等Wnt相关基因RNAi均未显著影响回避行为，支持核心模块cfz-2–gsk-3–bar-1的特异性。
**3.6 报告基因表达模式、探索性网络关联与遗传层级**
Pcfz-2::GFP和Pdsh-1::mCherry在头部区域具有神经元样形态的细胞亚群中重叠表达，但未进行神经元特异性标记验证，仅提示潜在关联。PA14暴露后，cwn-2、cfz-2、dsh-1和bar-1表达水平随时间升高，gsk-3表达降低。PPI网络分析显示Wnt通路基因与回避相关基因存在预测关联，GO分析富集到Wnt信号、神经元迁移、受体结合等条目，KEGG分析富集到Wnt、mTOR、整合素和Notch信号通路。gsk-3(tm1237); npr-1(ur89)双突变体表型与gsk-3单突变体相似（0.62 vs 0.70），表明Wnt/gsk-3模块在遗传上位于npr-1通路下游。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，该研究提供了经典Wnt信号参与成年动物病原体回避行为的遗传学证据，且该作用难以仅用发育缺陷解释。报告基因表达模式与系统水平富集分析支持Wnt信号与回避相关细胞或调控网络的潜在关联，但未确立神经元特异性作用位点。cwn-2的作用因突变体运动缺陷需谨慎解读。研究局限性包括RNAi和常规突变体难以排除发育效应、回避指数存在批次间变异等。未来需借助细胞类型特异性敲除（如CRISPR/Cas9）、auxin诱导降解系统、体内钙成像等技术在神经元和环路水平进一步验证。
研究结论表明，经典Wnt信号通过cfz-2–dsh-1–gsk-3–bar-1模块参与C. elegans对PA14的回避行为调控，其中gsk-3为负调控因子，bar-1为正调控因子。遗传上位性分析支持cfz-2作用于gsk-3和bar-1上游，且该模块位于npr-1通路下游，提示经典Wnt信号在更广泛的行为调控网络中发挥作用，而非孤立的免疫效应通路。这些发现为理解多信号通路协同塑造行为决策提供了新视角。
