《International Journal of Pharmaceutics: X》：Design of liquid crystalline nanoparticles:
Linking composition to membrane interactions and siRNA delivery
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小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）疗法的临床转化严重依赖于能够保护核酸、实现高效细胞摄取并促进胞质释放的递送系统。液晶纳米颗粒（liquid crystalline nanoparticles，LCNs）因其可调控的内部纳米
小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）疗法的临床转化严重依赖于能够保护核酸、实现高效细胞摄取并促进胞质释放的递送系统。液晶纳米颗粒（liquid crystalline nanoparticles，LCNs）因其可调控的内部纳米结构及生物相容性而成为有前景的载体，然而组成如何控制膜亲和力及生物学性能的相关认识仍十分有限。本研究比较了由单油酸甘油酯、油酸、聚（烯丙胺盐酸盐）及泊洛沙姆407（poloxamer 407，P407）或泊洛沙姆188（poloxamer 188，P188）配制的两种阳离子反六方LCNs。LCN-P407和LCN-P188均具有反六方组织、150–185 nm的平均直径、低多分散性（0.09–0.18）、正zeta电位（10–20 mV）以及对RNase A消化siRNA的保护能力。Langmuir等温线和Brewster角显微镜显示二者对二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）单层具有显著的吸附和扩张作用，其中LCN-P188诱导更强的扰动，与其相对于LCN-P407更高的细胞毒性（细胞死亡增加约20%）一致。关键的是，LCN-P407递送的siRNA摄取量显著高于LCN-P188（>1.7倍）。在功能验证方面，研究人员证明了LCN-P407-siTNFα在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中诱导强效基因沉默，根据颗粒浓度和孵育时间的不同，TNFα分泌减少1.2–3.5倍。LCN-P188-siTNFα仅产生延迟且适度的降低（1.3–1.6倍）。此外，在去角质猪皮肤中，LCN-P407也表现出优异的皮肤渗透能力，可将siRNA有效递送至活性表皮和真皮。综上所述，这些结果揭示了LCN组成、膜亲和力与功能性能之间的直接关系，为基于LCN的RNA治疗载体合理设计提供了机制见解。
**液晶纳米颗粒组成与膜相互作用及siRNA递送关联性的系统研究**
**一、研究背景与目的**
小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）疗法作为一种能够瞬时沉默传统意义上不可成药靶点的治疗策略，其临床价值已通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）治疗药物的获批得到验证。然而，siRNA的临床转化仍面临多重屏障：其高分子量和多聚阴离子特性导致与细胞膜产生静电排斥而阻碍细胞摄取，同时极易被核酸酶快速降解。因此，开发兼具生物相容性、可控界面性质及高效胞质递送能力的纳米载体成为该领域的核心挑战。
非层状液晶纳米颗粒（liquid crystalline nanoparticles，LCNs），特别是反六方和双连续立方介观结构，因其高度有序的内部纳米结构、结构稳健性以及促进膜融合和货物释放的能力而备受关注。尽管已有研究表明非层状脂质介观相能够增强膜融合并促进治疗性RNA的内涵体逃逸，但关于空间稳定剂（steric stabilizer）结构及阳离子聚合物掺入对界面力学特性和功能基因沉默效果的影响仍缺乏明确认识。聚阳离子的引入对于核酸负载至关重要，然而液晶结构对这些分子高度敏感，电荷、堆积及对胞内pH的响应均可引起介观相变。此外，聚环氧乙烷（poly(ethylene oxide)，PEO）/聚环氧丙烷（poly(propylene oxide)，PPO）嵌段组成的细微差异可改变表面冠层组织、膜插入动力学及胞内靶向行为，最终影响生物学性能。基于上述知识缺口，本研究系统探究了泊洛沙姆结构及聚阳离子掺入对反六方LCNs的胶体行为、内部介观结构、膜插入及siRNA递送效率的调控作用。
**二、主要技术方法**
本研究采用自上而下法制备LCNs，包括体相介观相水化及超声破碎。基础凝胶以8:1:91（w/w/w）的单油酸甘油酯（monoolein，MO）/油酸（oleic acid，OA）/水相比例配制，水相含0.01 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）及P407或P188（0.5%、1%、1.5% w/v），阳离子制剂另含0.5%（w/v）聚（烯丙胺盐酸盐）（poly(allylamine hydrochloride)，PAH）。动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和纳米颗粒跟踪分析用于表征水合粒径、zeta电位及颗粒浓度；RiboGreen?法、琼脂糖凝胶电泳、圆二色光谱（circular dichroism，CD）用于评估siRNA结合效率、释放行为、核酸酶保护能力及构象稳定性；小角X射线散射（small angle X-ray scattering，SAXS）和冷冻电镜（cryogenic electron microscopy，Cryo-EM）用于确定内部介观结构及形貌。Langmuir单层技术和Brewster角显微镜（Brewster angle microscopy，BAM）用于研究LCNs与1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC）单层的相互作用。细胞实验采用HaCaT人永生化角质形成细胞和Raw264.7鼠巨噬细胞系（ATCC TIB-71）；流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）评估细胞摄取；LPS刺激的Raw264.7细胞模型用于验证TNFα基因沉默效果；去角质猪皮肤配合Franz扩散池用于体外皮肤分布研究。
**三、研究结果**
**3.1 LCN表征**
研究成功制备了MO/OA为主要成分的LCNs，两种泊洛沙姆（P407和P188）均能形成稳定的胶体分散体系。粒径分析显示，增加稳定剂浓度可使粒径从167 nm降至147 nm（LCNn-P407）和从165 nm降至132 nm（LCNn-P188），这归因于界面张力降低和空间稳定作用增强。长期储存研究中，LCNn-P407在粒径、多分散性和zeta电位维持方面优于LCNn-P188，反映了P407具有更长的PPO锚定段和更厚的PEO水化冠层这一平衡的界面结构。PAH（0.5% w/v）掺入后，LCNp-P407保持了与中性体系相当的胶体参数，而LCNp-P188粒径增大至185.2 nm且zeta电位高达约+20 mV。两种阳离子制剂对20 μM siRNA的复合效率均超过96%，且能有效保护siRNA免受RNase A降解达24小时。圆二色光谱证实siRNA在复合过程中保持A型螺旋构象，经肝素竞争释放后可完全恢复天然构象。
**3.2 LCN内部结构与形貌表征**
SAXS分析确认所有LCN制剂均呈现反六方介观结构，三个Bragg反射位于相对位置1、√3和√4，分别对应（100）、（110）和（200）晶面。OA的C18酰基链与MO匹配，促进楔形分子几何构型并有利于负界面曲率。随着稳定剂浓度增加，晶格参数的减少幅度≤0.04 nm，表明其主要吸附在纳米颗粒表面而非插入脂质界面。PAH掺入导致晶格参数减少0.21–0.23 nm，归因于内部水通道的部分脱水，但未引起介观相转变。siRNA复合后六方相特征得以保持，仅出现轻微晶格参数减小，支持siRNA定位于水通道并与PAH胺基发生静电相互作用。Cryo-EM显示纳米颗粒呈拉长的六边形和准球形形貌，内部六方有序性通过FFT模式得到确认。
**3.3 LCN与Langmuir单层的相互作用**
在DPPC单层模型中，所有LCN制剂均表现出浓度依赖性的单层扩张效应，表明纳米颗粒能够插入脂质单层。LCN-P188诱导的分子面积变化（ΔArea）大于LCN-P407，说明P188较短的PEO链使得液晶结构暴露更充分，从而增强了与DPPC的亲和力。压缩模量（C
s?1）的降低表明LCN插入使单层向更流动的状态转变。BAM图像证实即使在高压（>15 mN/m）条件下LCN仍保留在空气-水界面，显示了与DPPC的高亲和力。siRNA复合后等温线轮廓基本不变，但ΔArea略有增加，提示siRNA负载增强了LCN在界面的吸附。
**3.4 LCN-siRNA复合物的细胞与组织相互作用**
细胞毒性评估显示所有制剂的半数抑制浓度（IC
50）在90–110 μg MO/mL之间，阳离子制剂毒性高于阴离子对应物，其中LCNp-P188毒性最强（100 μg MO/mL时活力为52%），反映了更强的静电和疏水膜相互作用。在亚毒浓度（8 μg MO/mL）下，LCNp-P407介导的siRNA摄取量较LCNp-P188高1.2–1.7倍，CLSM图像显示LCNp-P407-siRNA在胞质和核周区域产生更强荧光信号，且细胞形态保持完整。在功能验证方面，LCNp-P407-siTNFα在LPS刺激的Raw264.7巨噬细胞中于所有时间点均产生1.2–3.5倍的TNFα分泌抑制，且呈剂量和时间依赖性；而LCNp-P188-siTNFα仅在24和48小时产生1.3–1.6倍的延迟且适度的降低。在去角质猪皮肤模型中，LCNp-P407-siRNA在活性表皮和真皮中产生显著更高的荧光强度，表明其经皮递送效率优于LCNp-P188。
**四、讨论与结论**
本研究通过多尺度系统比较，揭示了稳定剂结构（PEO/PPO嵌段组成）对LCN生物学性能的决定性影响。研究表明，P407因具有更长的PPO锚定段和更厚的PEO水化冠层，在维持胶体稳定性、降低细胞毒性、增强细胞摄取和功能基因沉默方面均优于P188。值得注意的是，表面电荷并非性能的唯一决定因素——尽管LCNp-P188具有更高的正zeta电位（+20 mV vs +10 mV），但其递送效率反而较低，这归因于其与膜的过度相互作用导致膜破坏和细胞毒性增强，同时可能限制了有效的胞质释放。研究还发现，P407较长的PPO段可能通过促进膜插入和有利的内吞分选途径，实现了更高效的胞质siRNA释放。在经皮递送方面，P407的纳米尺寸效应、MO介导的渗透增强作用以及稳定剂依赖的脂质相互作用共同促进了siRNA向活性皮肤层的递送。
本研究建立了一个将LCN组成、膜亲和力与功能性能直接关联的系统框架，证明稳定剂驱动的界面组织而非单独的表面电荷是决定生物学性能的关键因素。这些发现为基于LCN的RNA治疗载体合理设计提供了重要的机制见解，并确定P407为该平台的首选稳定剂，因其兼具充分的膜相互作用、较低的细胞毒性、优异的胶体稳定性和卓越的功能递送能力。该研究发表于《International Journal of Pharmaceutics: X》。
