《Frontiers in Immunology》：Integrated machine learning and transcriptomics reveal immune infiltration-related orthologous transcription genes in cerebral ischemic injury
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摘要背景：缺血性脑损伤是全球死亡和残疾的主要因素。尽管已有广泛的病理学特征描述，但对啮齿动物转录组数据的系统性整合仍然有限。本研究探讨了脑缺血模型中直系同源转录因子（TFs）及其在调控神经炎症中的作用，以开发新型诊断和/或预测性生物标志物。方法：研究人员采用整
摘要背景：缺血性脑损伤是全球死亡和残疾的主要因素。尽管已有广泛的病理学特征描述，但对啮齿动物转录组数据的系统性整合仍然有限。本研究探讨了脑缺血模型中直系同源转录因子（TFs）及其在调控神经炎症中的作用，以开发新型诊断和/或预测性生物标志物。方法：研究人员采用整合生物信息学方法分析了来自十个公共数据集的RNA-seq数据。首先从整合的大鼠和小鼠数据集中识别出稳定上调和下调的差异表达基因（DEGs），随后进行功能富集分析。从这些稳定DEGs中筛选出在两个物种中共同表达的直系同源TFs，并对其进行功能表征。利用机器学习，从这些保守TFs中鉴定出一个包含五个TFs（Atf3、Maff、Cebpa、Myc和Relb）的诊断生物标志物组合，并评估了该模型的临床价值和诊断效能。基于CIBERSORT的免疫细胞浸润分析使用公共数据集和内部样本（SD大鼠HIE模型；C57BL/6小鼠MCAO模型）进行，揭示了生物标志物与巨噬细胞之间的关联。通过scRNA-seq数据进一步评估了空间定位。关键发现通过qRT-PCR和免疫荧光染色在体外得到验证。结果：大鼠和小鼠共有的稳定DEGs主要富集在免疫细胞分化、免疫反应和突触信号传导中。筛选鉴定出51个在白细胞分化和发育通路中同样富集的直系同源TFs。机器学习衍生的生物标志物组合（Atf3、Maff、Cebpa、Myc、Relb）表现出较高的诊断性能。免疫浸润分析显示Atf3、Cebpa、Relb与巨噬细胞在不同数据集和模型中存在显著关联。scRNA-seq将其主要表达定位于小胶质细胞。体外验证证实Cebpa和Relb主要定位于小胶质细胞内。结论：本研究确定了Cebpa和Relb作为啮齿动物脑缺血损伤中的直系同源TFs，并揭示了它们与神经免疫失调的功能关联，提示其作为新型生物标志物的潜力。
论文解读：基于整合转录组学与机器学习的脑缺血损伤免疫浸润相关直系同源转录因子研究
**研究背景与问题**
缺血性脑损伤是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。尽管对其病理机制已有大量表征，但针对啮齿动物模型的转录组数据缺乏系统性整合，现有研究多局限于单一物种、单一模型或单一时间点，难以识别在不同生物学背景下稳定存在的核心调控因子。转录因子（TFs）作为调控基因表达的关键蛋白，其直系同源基因在跨物种间具有高度保守的序列和调控网络，但它们在脑缺血后神经免疫反应中的保守调控作用，尤其是小胶质细胞这一关键细胞类型中的功能机制，尚未得到充分阐明。因此，系统整合多物种、多模型的转录组数据，结合机器学习与实验验证，筛选并鉴定啮齿动物脑缺血中保守的直系同源TFs，并阐明其在神经免疫调控中的作用机制，对于填补研究空白及开发跨物种诊断标志物和治疗靶点具有重要意义。
**研究内容与结论**
研究人员整合了来自SRA和GSA数据库的10个公共RNA-seq数据集（涵盖小鼠和大鼠的永久性MCAO、短暂性MCAO及远端缺氧模型），通过统一流程重新分析，鉴定出在两种啮齿动物中稳定上调和下调的差异表达基因（DEGs）。功能富集分析显示，上调的DEGs主要富集于免疫细胞分化和免疫反应通路，而下调的DEGs则主要涉及神经元突触信号传导。进一步筛选获得51个在两物种中共同表达的直系同源TFs，这些TFs富集于白细胞分化和发育通路。利用LASSO、SVM-RFE和随机森林三种机器学习算法，鉴定出包含Atf3、Maff、Cebpa、Myc和Relb五个TFs的诊断标志物组合，并通过列线图、校准曲线和决策曲线分析验证了模型的预测性能。在外部数据集GSE32529和内部小鼠MCAO、大鼠HIE模型中的ROC分析显示，Cebpa、Relb和Myc具有稳定的诊断价值。免疫浸润分析（CIBERSORT）揭示巨噬细胞是脑缺血后变化最显著的免疫细胞群，且关键TFs与巨噬细胞标志物（Cd86、Cd80、Cd163、Arg1等）显著相关。单细胞RNA-seq数据显示Atf3、Cebpa、Myc和Relb主要表达于小胶质细胞，空间转录组数据进一步支持其基线分布。体外qRT-PCR和免疫荧光染色验证了Cebpa和Relb与小胶质细胞标志物Iba1的显著共定位，而Atf3的共定位程度较低。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。
**主要关键技术方法**
研究采用整合生物信息学方法，包括：①从公共数据库（SRA、GSA）收集并标准化处理10个RNA-seq数据集（7个小鼠、3个大鼠，共129个样本）；②利用Limma包进行差异表达分析，并通过评分系统筛选稳定DEGs；③使用OrthoFinder鉴定小鼠和大鼠间的直系同源关系；④采用三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、RF）筛选核心TFs，通过ROC曲线评估诊断效能；⑤利用CIBERSORT算法进行免疫细胞浸润反卷积分析；⑥单细胞RNA-seq数据分析（Seurat、SingleR、CellChat）和空间转录组数据验证；⑦通过qRT-PCR和免疫荧光染色在体内外模型（成年小鼠MCAO模型和新生SD大鼠HIE模型）中进行验证。
**研究结果**
**1. 稳定差异表达基因的鉴定与功能富集分析**：在大鼠和小鼠模型中分别鉴定出稳定上调和下调的DEGs，上调基因富集于免疫细胞分化和免疫反应，下调基因富集于突触信号传导，表明免疫反应和突触功能是脑缺血后保守的核心病理过程。
**2. 直系同源TFs的筛选与功能表征**：从稳定DEGs中筛选出51个直系同源TFs，功能富集分析显示这些TFs参与白细胞分化、应激响应转录调控等通路，支持其在神经免疫调控中的潜在作用。
**3. 机器学习鉴定核心TFs及诊断模型构建**：三种算法交叉得到6个重叠基因（Atf3、Maff、Cebpa、Myc、Relb、Zfp217），其中Zfp217因数据完全分离被排除，最终建立包含5个TFs的诊断模型。该模型在合并数据集和外部验证中表现出较高的AUC值（0.7-1.0），其中Cebpa、Relb和Myc在不同数据集中诊断性能稳定。
**4. 免疫浸润分析揭示巨噬细胞关联**：在小鼠和大鼠模型中，缺血组M0/M1巨噬细胞显著增加，M2巨噬细胞和T细胞亚群减少，关键TFs与巨噬细胞标志物呈正相关，表明这些TFs可能参与巨噬细胞介导的神经炎症反应。
**5. 单细胞与空间定位验证小胶质细胞表达**：单细胞RNA-seq显示Atf3、Cebpa、Myc和Relb主要富集于小胶质细胞簇，空间转录组数据支持其基线分布。体内实验证实Cebpa和Relb与Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞显著共定位，而Atf3共定位程度低，提示Cebpa和Relb是更具特异性的小胶质细胞相关TFs。
**6. 体外实验验证**：在新生大鼠HIE模型中，qRT-PCR显示Cebpa和Relb在缺血后1天和3天表达显著上调，并与小胶质细胞标志物（Aif1、Tmem119、Trem2）呈正相关，免疫荧光染色进一步确认其在小胶质细胞中的定位。
**讨论与结论**
研究表明，Cebpa和Relb是啮齿动物脑缺血损伤中与小胶质细胞/巨噬细胞相关的直系同源TFs，其表达变化与神经免疫失调密切相关，提示其作为新型生物标志物和治疗靶点的潜力。该研究通过多数据集整合和机器学习策略，克服了单模型研究的局限性，为跨物种转化研究提供了基础。然而，研究存在局限性：CIBERSORT无法区分脑内常驻小胶质细胞和浸润巨噬细胞；未系统分析不同时间点的动态表达变化；啮齿动物向人类转化需进一步验证。未来需通过高通量空间转录组学、单细胞测序及功能增益/缺失实验，深入阐明Cebpa和Relb在神经免疫调控中的具体机制，并探索其在人类缺血性脑卒中中的诊断价值。
