一种模拟乳腺癌骨转移的新型骨与癌细胞离体共培养方法

《BMC Methods》：A novel bone and cancer cells co-culture methodology to model breast cancer metastasis to bone ex vivo

　　

摘要

研究背景：晚期癌症研究中的主要挑战之一是研究癌细胞与转移组织之间的直接相互作用。转移是一个低效的多步骤过程，仅有一小部分癌细胞能够成功定殖于新的微环境。骨是乳腺癌和前列腺癌转移最常见的组织，也是所有癌症类型中第三常见的转移部位。研究人员提出了一种用于模拟骨转移的离体（ex vivo）共培养方案，该方案能够直接研究癌细胞与天然骨及骨髓微环境之间的相互作用。

方法：该流程包括小鼠长骨（股骨和胫骨）的提取与制备、将癌细胞注射入骨髓腔、共培养的维持以及用于下游分析的样本处理。该方案支持多种功能性读出，包括肿瘤细胞活力的生物发光成像（bioluminescence imaging, BLI）、条件培养基取样，以及下游组织分析，如免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）或微型计算机断层扫描（micro-computed tomography, μCT）。培养建立流程可在一天内完成，此后的每日培养基维护所需时间极少。最终样本处理时间因所完成的分析类型而异。

讨论：该系统能够维持骨、骨髓和癌细胞存活并保持代谢活性长达四周，同时保留骨微环境的异质性。该方案高度适用于多种癌症类型和不同骨基因型，并能够在复杂微环境中实现癌细胞定殖的高通量功能研究。该方案要求操作者具备哺乳动物细胞培养和小鼠解剖的基本技能，适用于研究转移、肿瘤-基质相互作用或骨微环境中的临床前治疗筛选的研究人员。

临床试验编号：不适用（Not applicable）

**一种模拟乳腺癌骨转移的新型骨与癌细胞离体共培养方法——论文解读**

**一、研究背景与问题**

转移是导致大多数乳腺癌相关死亡的原因，然而许多治疗策略仍主要针对原发肿瘤，尽管有充分证据表明转移灶往往对相同的疗法不敏感。骨是乳腺癌远处转移最常见的部位，约75%的晚期乳腺癌患者会发生骨骼受累。在转移性肿瘤发展过程中，癌细胞经历显著的形态学和生理学改变以适应新环境。至癌细胞定殖于远处组织时，其常缺乏用于靶向治疗的生物标志物；雌激素受体、孕激素受体及HER2等关键治疗靶点的表达在原发肿瘤与骨转移灶之间常存在差异，这使得癌症患者仅剩侵袭性化疗作为治疗选择。因此，理解癌细胞与其继发组织宿主之间的直接相互作用，对于测试针对新微环境中转移细胞的不同治疗方法至关重要。

骨转移研究的主要障碍之一一直是在细胞培养环境中无法再现骨与骨髓微环境的复杂性。绝大多数骨转移研究使用体外（in vitro）和体内（in vivo）实验模型，两者均存在若干局限性。体外模型通常由单层细胞构成，无法模拟完整骨的三维结构或异质性，导致体外模型的结果难以在更复杂的环境中重现。相比之下，体内模型由于整个生物体的高度复杂性，往往难以控制特定变量。此外，体内转移模型可能受到原发性肿瘤负荷混杂因素的制约，需要提前处死动物，从而影响所得数据的解读。

离体（ex vivo）培养方法近年来日益普及，部分归因于其相较于体内和体外实验平台的优势。工程化模型，如羟基磷灰石纳米颗粒和仿生胶原水凝胶，已能够分析骨力学性质对肿瘤细胞行为的影响。其他离体培养系统，如骨芯片（bone-on-a-chip）和微流控装置，能够实现骨微环境固有多个细胞谱系的共培养。这些系统允许进行多重治疗测试或与癌细胞的可调基质串扰分析。然而，这些系统未能完全捕捉骨微环境的复杂性，也未维持正常的组织结构。因此，研究人员决定对先前聚焦于大型哺乳动物小梁骨核心培养的已发表工作加以改进，将其调整用于培养完整的小鼠骨，同时维持骨与骨髓微环境中发现的异质性。此外，研究人员在培养期前向这些骨中注射小鼠乳腺上皮癌细胞，以在受控的培养环境中研究癌细胞与骨微环境的直接相互作用。

**二、研究内容与结论**

该方案的设计目标是一种简单高效的方法，利用小鼠骨外植体在小鼠骨及骨髓微环境背景下培养小鼠上皮性乳腺癌细胞。然而，该方案可加以调整，用于培养任何已知转移至骨的癌细胞类型，并使用与本文所述遗传背景不同的小鼠骨。这使研究人员能够评估治疗或微环境操作对骨定殖的影响。此外，如果该方案中使用的癌细胞携带荧光素酶报告基因，则在整个培养期间可使用生物发光成像（BLI）来测量癌细胞增殖和代谢活力。因此，实验变量（如药理学治疗）对癌细胞在骨内存活和增殖能力的直接影响可在整个培养期间被量化。该培养方法还允许在部分换液期间每日回收条件培养基，随后可分析其中的分泌因子，以追踪癌细胞骨定殖的进展。此外，用于开发该方案的小鼠长骨可在灌注骨生物反应器模型中培养，该模型利用小型马达传递低强度机械刺激，并利用培养基流动产生剪切应力。这种设置能够量化培养期间的骨破坏和骨沉积，促进骨转移病灶的测量。培养期后的μCT和组织学分析可用于评估肿瘤相关的骨重塑、免疫细胞和基质细胞群以及肿瘤病理学。

**三、主要关键技术方法**

该方案的核心实验流程涉及以下主要技术环节：从FVB/N小鼠中提取股骨和胫骨长骨外植体；使用27G针头将表达荧光素酶的PyMT小鼠乳腺上皮癌细胞系（来自Conor C. Lynch的赠予）以2.5×10?细胞/10 μL的浓度注射入骨髓腔；在低吸附12孔板中于37°C、5% CO?条件下共培养，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基维持，每日半量换液；培养期间通过IVIS Lumina成像系统进行生物发光成像（BLI）监测癌细胞活力，使用CellTiter-Blue试剂检测骨组织代谢活性；培养结束后收取条件培养基进行酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分泌因子；骨样本经4%多聚甲醛固定、10% EDTA（pH 7.6）脱钙后，进行石蜡包埋、切片及免疫组织化学（IHC）染色；微型计算机断层扫描（μCT）在脱钙前完成，用于评估骨微结构参数。

**四、研究结果**

**骨与骨髓细胞在共培养体系中存活并保持代谢活性。** 通过CellTiter-Blue活力测定，研究人员证实培养骨相较于冻融灭活的“死骨”对照在长达四周的培养期内维持了显著更高的代谢活性。该测定基于深蓝色刃天青（resazurin）向粉红色荧光试卤灵（resorufin）的转化，骨外植体数量与代谢活性水平呈比例增加。

**骨微环境中的多种细胞类型在培养后仍可被检测。** 免疫组织化学（IHC）染色结果显示，共培养两周后的骨样本中可检测到CD4+辅助性T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD20+ B细胞、CD68+巨噬细胞、Ly6G/6C+中性粒细胞、endomucin+内皮细胞、CD61+巨核细胞和CD71+红系前体细胞等多种免疫细胞和骨细胞。注射的PyMT乳腺癌细胞在培养四周后仍存活，并通过泛细胞角蛋白染色得到确认。

**骨重塑相关分泌因子可在条件培养基中检测。** 培养第5天收集的条件培养基中，通过ELISA可检测到骨重塑因子RANKL（核因子κB受体活化因子配体）和OPG（骨保护素），表明培养骨中的骨细胞信号通路保持活跃状态。

**培养后骨微结构得到维持。** μCT分析显示，培养两周后胫骨近端的骨体积分数（骨体积/总体积，BV/TV）和小梁骨微结构参数与新鲜未培养骨相比无显著差异，证实培养期间骨组织结构得到良好保存。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，该离体共培养系统的关键优势在于其能够在长达四周的时间内维持骨、骨髓和癌细胞三方同时存活且代谢活跃，同时保留骨微环境的天然异质性。该系统具有高度适应性，可用于多种癌症类型和不同遗传背景的小鼠骨来源。该方案不依赖外源支架或工程化基质，而是利用天然骨组织作为培养环境，因而更接近体内真实情况。值得注意的是，研究人员在早期试验中发现人类MDA-MB-231乳腺癌细胞在该小鼠骨外植体中的存活率低于同系小鼠PyMT细胞，提示骨髓中的免疫细胞可能对异种细胞产生一定的免疫排斥反应。这一发现表明，在使用人源细胞系时需考虑免疫兼容性问题，或使用免疫缺陷小鼠来源的骨。

研究结论：研究人员提出了一种离体培养系统，使癌细胞能够在维持天然骨微环境异质性的小鼠骨外植体中生长。通过条件培养基取样以及骨结构和组织学分析，可以在骨中评估肿瘤生长和促进转移定殖的因子。该模型适用于多种实验条件，包括其他细胞系、不同来源的小鼠骨以及培养期间的治疗干预，为骨转移研究提供了一种兼具体内模型复杂性和体外模型可控性的实验平台，有望推动针对骨微环境中转移细胞的新型治疗策略的开发与评估。该论文发表于《BMC Methods》。