γ-氨基丁酸富集水稻通过永宁类芽孢杆菌DCY84T种子引发在体外共培养中增强屏障保护和神经保护生物活性

《Journal of Agriculture and Food Research》：Gamma-aminobutyric Acid-Enriched Rice Produced by Paenibacillus yonginensis DCY84T Seed Priming Enhances Barrier Protective and Neuroprotective Bioactivity In vitro Co-culture

　　

增强主粮作物中的功能性代谢物对于维持其营养和促进健康价值至关重要。γ-氨基丁酸（GABA）是一种具有公认抗炎和抗氧化活性的生物活性化合物；然而，通过可持续实践在水稻中富集该物质的研究仍不充分。本研究调查了永宁类芽孢杆菌DCY84T（Paenibacillus yonginensis DCY84T）水稻种子引发对收后稻米代谢物积累及相关生物活性的影响。DCY84T种子引发改变了稻米籽粒的代谢物谱，增加了包括GABA、γ-谷维素（gamma-oryzanol）和氨基酸在内的生物活性化合物，并增强了ABTS自由基清除能力（p < 0.05）。在SN21和SN22两个品种中，GABA含量分别增加了约2.0倍和1.4倍，同时伴随GABA生物合成关键酶谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase）编码基因的协同上调。代谢物富集的水稻提取物在Caco-2/RAW264.7共培养模型中通过保护紧密连接蛋白表达和抑制IL-1β、IL-6及TNF-α的产生，减轻了脂多糖诱导的肠道炎症。在Caco-2/SH-SY5Y肠-脑轴模型中，该水稻提取物使IL-8分泌减少约1.5倍，并使突触素（synaptophysin）表达增加1.63倍，表明其具有神经保护潜力。此外，DCY84T种子引发重塑了土壤微生物组，使其向与次生代谢物积累相关的类群转变，包括鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、Solibacteraceae和根瘤菌科（Rhizobiaceae）。总体而言，用DCY84T引发水稻种子展示了一种微生物-植物-代谢物策略，以增强收后稻米的营养品质，并赋予健康益处。

**论文解读文章**

**研究背景**
水稻是全球主要的主粮作物，但其天然功能性代谢物含量较低，限制了其营养和健康促进价值。γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白氨基酸，具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种生物活性，但天然水稻中GABA含量通常低于20 mg/100 g。现有提升GABA含量的方法（如发酵、育种、真空浸渍等）存在成本高、可持续性差等问题。植物根际促生菌（PGPR）种子引发是一种可持续的农业实践，可通过激活种子生理过程促进有益代谢物积累，但该方法对收后稻米营养成分和功能活性的影响尚不明确。本研究旨在评估永宁类芽孢杆菌DCY84T种子引发对收后稻米代谢物谱、肠道屏障保护、神经保护作用及根际微生物组的影响，以探索其作为功能性食品原料的潜力。论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。

**研究人员开展的研究**
研究人员采用田间试验，以两个水稻品种（SN21和SN22）为材料，进行DCY84T种子引发（菌液浸泡24 h），收获后分析稻米代谢物（氨基酸、GABA、γ-谷维素、二十八烷醇、总酚含量及ABTS自由基清除能力）。随后，利用Caco-2/RAW264.7共培养模型评估肠道屏障保护（检测紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin表达）和抗炎作用（检测IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白水平）；利用Caco-2/SH-SY5Y共培养模型评估神经保护作用（检测IL-8分泌及BDNF、Syp基因表达）。同时，通过16S rRNA扩增子测序（Illumina MiSeq平台）分析根际土壤微生物群落。种子来源为韩国首尔大学产业合作基金会，稻田试验于韩国全罗南道进行。

**主要关键技术方法**
关键技术方法包括：①种子引发——将水稻种子与DCY84T菌液（1×10⁸ CFU/mL）按1:3体积比浸泡24 h；②代谢物分析——使用氨基酸自动分析仪测定GABA和氨基酸，高效液相色谱（HPLC）测定γ-谷维素，气相色谱（GC）测定二十八烷醇，Folin-Ciocalteu法测定总酚，ABTS法测定自由基清除能力；③共培养模型——在Transwell系统中建立Caco-2/RAW264.7（肠道炎症模型）和Caco-2/SH-SY5Y（肠-脑轴模型），用脂多糖（LPS）诱导炎症；④基因表达分析——实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测GAD基因、紧密连接蛋白基因及炎症因子基因；⑤蛋白表达分析——Western blot检测紧密连接蛋白；⑥土壤微生物组分析——使用QIIME2进行DADA2去噪，基于SILVA数据库进行物种注释，LEfSe分析差异微生物。

**研究结果**

**3.1 DCY84T水稻种子引发提高收后稻米代谢物含量**
通过氨基酸分析发现，DCY84T引发组的所有氨基酸含量均高于对照组，其中SN22品种的增幅更显著（p < 0.001），且必需氨基酸（异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸）含量升高。此外，二十八烷醇和γ-谷维素水平也显著增加，SN22品种的总酚含量增加（p < 0.01），并伴随ABTS自由基清除能力增强（IC₅₀从9.5降至6.5 mg/mL，p < 0.001）。

**3.2 DCY84T水稻种子引发提高收后稻米GABA含量**
DCY84T引发后，SN21和SN22品种的GABA含量分别增加约2.0倍（至207.1 mg/100 g）和1.4倍（至119.8 mg/100 g）（p < 0.001）。GABA积累与谷氨酸脱羧酶（GAD）编码基因表达相关：SN21中三个GAD基因（OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3）均显著上调（p < 0.001），而SN22仅OsGAD1轻度上调（p < 0.05），表明品种依赖性GAD基因协同调控促进GABA积累。**基于SN21更高的GABA富集度，后续细胞实验选用SN21品种。**

**3.3 GABA富集水稻改善肠道屏障功能紊乱**
在Caco-2/RAW264.7共培养模型中，LPS处理导致Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1和occludin的基因及蛋白表达下降。DCY84T引发的SN21水稻提取物（SN21TRE）显著恢复ZO-1和claudin-1基因表达，并恢复ZO-1、claudin-1和occludin蛋白水平，效果优于对照组（SN21CON）。

**3.4 GABA富集水稻减轻全身炎症**
在Caco-2/RAW264.7共培养中，RAW264.7巨噬细胞暴露于LPS后，促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达和蛋白分泌均升高。SN21TRE处理显著降低这些炎症因子的水平，且效果优于SN21CON，表明DCY84T引发的GABA富集水稻具有更强的抗炎作用。

**3.5 GABA富集水稻调控神经炎症**
在Caco-2/SH-SY5Y共培养模型中，LPS诱导的肠屏障破坏导致IL-8分泌增加（肠侧和基底侧），并降低SH-SY5Y神经元中突触素（Syp）基因表达，但脑源性神经营养因子（BDNF）无显著变化。SN21TRE处理使IL-8分泌减少约1.5倍，并显著增加BDNF和Syp基因表达（Syp增加1.63倍），表明其通过肠-脑轴发挥神经保护作用。

**3.6 DCY84T水稻种子引发影响土壤微生物多样性和结构**
土壤微生物组分析显示，DCY84T引发组与对照组的α多样性（ACE和Shannon指数）无显著差异，但Bray-Curtis异质性分析表明两组微生物群落结构分离。DCY84T组和对照组分别有150和127个独有扩增子序列变体（ASV），共享115个ASV。在门水平，DCY84T组中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和浮霉菌门（Planctomycetota）相对丰度增加，而硝化螺旋菌门（Nitrospirota）和蓝细菌门（Cyanobacteria）减少。

**3.7 DCY84T水稻种子引发改变土壤微生物群落组成**
LEfSe分析（LDA>2.0，p<0.05，FDR<0.25）鉴定出DCY84T组中富集的生物标志物，包括Sphingomonadaceae、Solibacteraceae、Mycobacteriaceae、Rhizobiaceae和Verrucomicrobiaceae。Spearman相关分析显示，在门水平，疣微菌门（Verrucomicrobiota）和蛭弧菌门（Bdellovibrionota）与DCY84T处理正相关，而弯曲菌门（Campilobacteriota）、蓝细菌门和硝化螺旋菌门负相关；在属水平，Mycobacterium、Mesorhizobium和Bradyrhizobium等与DCY84T处理正相关。

**讨论与结论**
讨论部分指出，DCY84T种子引发通过上调GAD基因促进GABA积累，并可能通过谷氨酸底物供应增强GABA合成。GABA富集水稻通过恢复紧密连接蛋白表达和抑制炎症因子，减轻LPS诱导的肠道屏障损伤和全身炎症，并在肠-脑轴模型中抑制IL-8、促进BDNF和Syp表达，从而保护神经元功能。土壤微生物组变化（如Sphingomonadaceae和Rhizobiaceae富集）可能与植物次生代谢物积累相关，但具体机制需进一步整合代谢组学、同位素示踪和功能微生物组分析。本研究的局限性在于采用全米提取物，无法将生物活性完全归因于GABA。

**结论**：本研究表明，在栽培前进行永宁类芽孢杆菌DCY84T种子引发可促进水稻代谢物谱和根际微生物群落的品种依赖性变化，其中SN21品种表现出GABA积累增强，伴随OsGAD基因的协同上调。代谢物富集的水稻提取物在Caco-2/RAW264.7共培养模型中改善了LPS诱导的肠道屏障功能障碍和炎症反应，并在Caco-2/SH-SY5Y肠-脑轴模型中对炎症诱导的神经元损伤发挥神经保护作用。尽管GABA的具体贡献仍需进一步机制验证，但这些发现证明DCY84T种子引发是一种有前景且可持续的策略，用于生产具有增强营养品质和健康促进潜力的功能性水稻。