《Journal of Chromatography A》：Quantitative Analysis of Urinary Volatile Organic Compounds by Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography – Mass Spectrometry Under Low Sample Volume Conditions
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•本研究开发了一种基于HS-SPME–GC–MS的定量分析方法，用于检测尿液中的挥发性有机化合物。•仅需0.1毫升尿液即可实现可靠的VOC检测。•通过Box–Behnken实验设计优化了提取条件。•方法验证表明该技术具有良好的线性、灵敏度和回收率。•通过β参数分析，利用MHS-S
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本研究开发了一种基于HS-SPME–GC–MS的定量分析方法，用于检测尿液中的挥发性有机化合物。
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仅需0.1毫升尿液即可实现可靠的VOC检测。
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通过Box–Behnken实验设计优化了提取条件。
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方法验证表明该技术具有良好的线性、灵敏度和回收率。
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通过β参数分析，利用MHS-SPME评估了基质效应。
引言
由于能够反映早期的代谢变化，对生物样本（如尿液、唾液、呼气）中的挥发性有机化合物进行分析已成为判断生理和病理状态的重要手段[[1], [2], [3]]。然而，在使用小型生物样本库的样本或在大规模研究中将样本用于多种分析时，往往面临样本量有限的问题。
尿液中的VOC是富含代谢信息的化合物来源，与多种病理状况相关，包括癌症、代谢性疾病以及神经退行性疾病[[4], [5], [6]]。本研究选取了此前被认定为潜在尿液生物标志物的一组化合物，包括二甲基二硫化物、4-庚酮、环己醇、环己酮、苯酚、对甲酚、壬酸以及2,4-二叔丁基酚（2,4-DTBP），这些化合物属于不同的化学类别，挥发度也各不相同。
在前列腺癌患者中，二甲基二硫化物与4-庚酮、苯酚一同被认定为具有区分意义的尿液化合物[7]。非霍奇金B细胞淋巴瘤患者的4-庚酮浓度显著更高，且不同临床阶段的浓度也存在差异[8]。肾癌患者在肾切除术前体内环己酮水平较高，术后则有所下降[9]。在苯酚类VOC中，对甲酚与肝肾功能障碍有关[10]。自闭症谱系障碍儿童的尿液中对甲酚水平也偏高[11]。壬酸也被认为是乳腺癌的鉴别性VOC之一[12]。最后，2,4-DTBP在人类尿液中检出浓度相对较高，由于其持久性、生物累积性以及可能的内分泌干扰作用，被认为是一种环境暴露的潜在标志物[[13], [14], [15]]。
尽管人们对尿液VOC的研究越来越感兴趣，但对其进行可靠定量分析仍面临诸多挑战。尿液中的VOC浓度通常较低，一般在纳米摩尔每升到微摩尔每升之间；例如，某些尿液VOC的中位浓度在0.55纳米摩尔每升到11.60微摩尔每升之间，其中4-庚酮的中位浓度高达1674纳米摩尔每升，这就需要采用灵敏且选择性的预浓缩技术[16,17]。此外，尿液是一种结构复杂且变化多端的基质，其稀释程度、离子强度、pH值以及内源性代谢物组成都存在差异[18]。这些因素会显著影响顶空提取过程中的气液分配以及吸附/解吸过程，从而影响分析的准确性和重复性[19,20]。
目前已有多种分析技术可用于尿液VOC的检测，包括从吸附管中通过热脱附法提取、搅拌棒吸附萃取结合热脱附法（SBSE-TD），以及动态吹扫注入结合高压光电离质谱法（HPPI-MS），但这些方法往往需要昂贵的仪器设备，或是复杂的 方法优化和样本处理流程[21,22]。相比之下，顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）因其无需溶剂、简化了样本处理流程、可将采样和预浓缩步骤整合在一起，且适用于少量样本，成为生物基质中VOC检测最常用的技术之一[23]。
不过，目前大多数基于HS-SPME-GC-MS的尿液VOC研究主要是定性或半定量分析，绝对定量分析仍然较少。这类研究主要聚焦于生物标志物的发现以及疾病鉴别[24]。虽然已有针对某些VOC类别（如羰基化合物）的定量验证研究，但这些方法中的基质效应通常是通过斜率比较、回收率研究或内标校正来评估的[25,26]。能够覆盖多种化学类型的尿液VOC的分析方法仍然较为匮乏。优化研究表明，pH值、离子强度以及其他基质参数会影响VOC的提取效果[27]，但不同分析物和基质之间的差异可能尚未得到充分研究。尤其是，模拟尿液作为校准介质的适用性，以及其在样本量较小时能否再现真实尿液的提取行为，至今仍未得到充分验证。
为了解析由基质差异带来的提取差异，多重顶空固相微萃取（MHS-SPME）被作为一种有效工具，用于评估提取行为。通过对同一样本瓶进行多次萃取，可以分析分析信号的指数衰减规律，并计算出描述分析物提取行为的β参数。通过比较不同基质下的β值，可以判断提取平衡和质量传递行为的相似性或差异性，从而为评估基质效应提供实验依据[[28], [29], [30]]。
在样本量有限的条件下开发定量分析方法仍然面临诸多限制。本研究的目的是开发一种低样本量型的定量HS-SPME-GC-MS方法，用于同时检测尿液中的多种VOC。该方法基于与基质匹配的标准品进行外标校准，经过优化后，从线性、灵敏度、准确度和精密度等角度进行了性能评估。通过结合MHS-SPME和β参数，对比模拟尿液样本和真实尿液样本，研究了基质效应。本研究不仅实现了低容量下的定量分析，还建立了相应的分析流程，同时证明了模拟尿液可作为低容量尿液VOC分析的合适校准基质。
章节摘要
试剂、化学品及材料
本研究使用的试剂如下：二甲基二硫化物（99%）、壬酸（97%）、4-庚酮（98%）、对甲酚（99%）、2,4-二叔丁基酚（99%）以及环己醇（99%），均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。环己酮（99.8%）购自比利时吉尔市的Acros Organics公司，结晶苯酚（ACS级）则购自德国达姆施塔特的AppliChem PanReac公司。
用于HS-SPME的固定相为二乙烯苯/羧基/聚二甲基硅氧烷复合物（DVB/CAR/PDMS，粒径50/30微米，品牌StableFlex，长度1厘米）
基于Box-Behnken设计的HS-SPME-GC-MS VOC提取优化：变量影响及最佳条件
通过HS-SPME-GC-MS从尿液中提取VOC需要考虑多个实验变量，因此需要进行系统优化，以实现可重复的检测结果和足够的分析灵敏度。
通过Box-Behnken设计对关键变量（即孵育温度、孵育时间以及提取时间）进行了优化。在确定这些变量及其取值范围后，共进行了17次结构化的实验（见表1）。
帕累托图见图1
结论
本研究开发了一种基于HS-SPME-GC-MS的分析方法，通过实验设计、可控的基质模拟以及基质效应评估，实现了对人体尿液中相关VOC的定量测定。通过Box-Behnken设计优化后发现，孵育温度和提取时间是影响提取效果的主要因素，而一旦达到最低平衡状态，孵育时间的影响则相对较小，最优孵育温度为55摄氏度。
CRediT作者贡献说明
Esther Cámara Valero：文章撰写——审阅与编辑、原文撰写、数据可视化、方法学验证、软件应用、研究设计、正式分析、数据整理。Ana Beltrán Sanahuja：文章撰写——审阅与编辑、数据可视化、方法学验证、研究监督、项目管理、方法学设计、研究实施、数据整理、概念构建。Enrique de Madaria：文章撰写——审阅与编辑、研究监督、项目管理、资金申请、概念构建。José Luis Todolí Torró：
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益、个人关系、所属机构关联或其他形式的利益冲突。
资助情况
作者感谢西班牙科学、创新与大学部的西班牙国家研究机构（AEI）提供的财政支持（项目编号：PID2021-127566NB-I00）。
Esther Cámara Valero|Ana Beltrán Sanahuja|Enrique de Madaria|José Luis Todolí Torró
