红参多糖水解得到的九个寡糖的制备、分离、结构表征及心肌细胞保护作用

《Journal of Food Composition and Analysis》：Preparation, isolation, structural characterization, and cardiomyocyte protection of nine oligosaccharides hydrolyzed from red ginseng polysaccharides

　　

红参（Red ginseng, RG）因其补益特性而被广泛食用。研究人员从红参中分离得到一系列具有不同聚合度（degree of polymerization, DP）的寡糖（F2–F10）。粗红参多糖（RGP）的提取率达到13.32%。分离过程包括总多糖的部分酸水解，随后进行透析和制备型亲水相互作用色谱（HILIC）分离。采用一系列分析技术系统研究了这些寡糖的结构特征，包括配备蒸发光散射检测器的高效液相色谱（HPLC-ELSD）、亲水相互作用色谱/离子迁移-四极杆飞行时间质谱（HILIC/IM-QTOF-MS）以及核磁共振波谱（NMR）。综合分析表明，其主要结构基序为α-(1→4)-连接的葡萄糖基残基。每个分离得到的寡糖产物均为含有α-和β-异头物的混合物，这是变旋作用的结果。经HPLC-ELSD测定，所有九个寡糖（F2–F10）的纯度均超过92%，其中大多数组分纯度达到98%以上。此外，利用H9c2心肌细胞的氧-葡萄糖剥夺/复灌（oxygen-glucose deprivation and reperfusion, OGD/R）体外模型评估了这些寡糖的心脏保护潜力。研究结果表明，这些寡糖对心肌细胞具有显著的保护作用。本研究报道了来源于红参的麦芽寡糖同系物的分离和结构表征，并强调了其心脏保护潜力。

红参（Red ginseng, RG）是以人参根经蒸制干燥而成，在东亚广泛作为滋补品使用。现有研究多聚焦于皂苷类成分，而多糖作为另一类重要活性大分子，也表现出免疫调节和心血管保护作用。然而，天然多糖通常分子量较大，其药理作用往往需要水解为寡糖才能发挥。例如，肝素水解后抗凝活性随分子量变化。此前对红参多糖（RGP）的研究证实，其可调节线粒体功能并减轻心肌细胞凋亡，但主要活性成分和作用机制仍不清楚。因此，本研究系统分离和表征红参多糖中的寡糖，并评估其心肌保护活性。

本研究通过温和酸水解和超滤等方法，从红参总多糖中获得分子量<3 kDa的寡糖混合物（RGP3K），并利用半制备型亲水相互作用色谱（HILIC）分离出九个寡糖F2–F10。通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）、亲水相互作用色谱/离子迁移-四极杆飞行时间质谱（HILIC/IM-QTOF-MS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振波谱（NMR）等手段，确定这些化合物均为以α-(1→4)糖苷键连接的麦芽寡糖同系物。纯度分析显示，所有九个寡糖纯度均超过92%，多数高于98%。在H9c2心肌细胞氧-葡萄糖剥夺/复灌（OGD/R）模型中，寡糖表现出显著的心脏保护作用，其中F10效果最强，通过调控PCAF–PGC1α通路抑制凋亡并促进线粒体生物合成。该研究为寡糖的制备和结构鉴定提供了优化策略，并揭示了红参寡糖的心脏保护潜力，论文发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

研究主要采用以下技术方法：红参样品购自中国白山某中药公司；H9c2细胞来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。粗多糖经超声辅助提取、乙醇沉淀和Sevag法去蛋白获得；以0.5 M三氟乙酸（TFA）部分酸水解，超滤截取<3 kDa组分；半制备HPLC（XBridge BEH Amide柱）分离寡糖。结构表征使用HPLC-ELSD、负离子模式HILIC/IM-QTOF-MS、FT-IR和NMR（包括COSY、HSQC、HMBC）。细胞实验采用OGD/R模型，使用流式细胞术（Annexin V-FITC/PI凋亡检测、JC-1膜电位检测）、Mito-Tracker线粒体荧光标记、qPCR基因表达分析以及shRNA基因敲低技术验证通路。

**3.1 从红参制备分级多糖和寡糖**
超声辅助提取和乙醇沉淀得到粗RGP，产率13.32%。酸水解和超滤分级后，RGP3K、RGP3–10K和RGP10K的产率分别为60.0%、18.0%和9.5%。半制备HPLC从RGP3K中分离出11个峰，其中F2–F10被收集用于后续研究。

**3.2 基于HPLC-ELSD的寡糖纯度分析**
通过与麦芽糖标准品比较，分离得到的寡糖保留时间与相应的麦芽糖（Mal-2至Mal-6）一致，纯度均超过92%，大部分达98%以上，表明该方法高效准确。

**3.3 HILIC/IM-QTOF-MS结构表征**
负离子质谱显示F2–F10的分子离子峰质荷比（m/z）为341至1637，相邻同系物相差162 Da（葡萄糖基），分子式符合(C₆H₁₂O₆)_n（n=2–10）。二级质谱行为一致，表明为一组连续的麦芽寡糖同系物。

**3.4 FT-IR和NMR分析**
红外光谱在844±8 cm^-1处显示α构型特征吸收，在891±7 cm^-1处有较弱吸收，提示存在α/β异头物。二维NMR（COSY、HSQC、HMBC）证实F2为α-(1→4)糖苷键连接的二糖，由α-D-Glc-(1→4)-β-D-Glc和α-D-Glc-(1→4)-α-D-Glc组成，且由于变旋作用两种异头物共存。F3–F10具有类似结构，均为麦芽寡糖同系物。

**3.5 心肌细胞保护作用**
**3.5.1 F10抑制OGD/R诱导的凋亡并改善线粒体功能**
流式细胞术显示，RGP3K、F3、F4和F10预处理（50 μg/mL，48 h）可显著降低OGD/R诱导的H9c2细胞凋亡率，其中F10保护作用最强。Mito-Tracker荧光标记显示F10预处理增加线粒体生物合成；JC-1染色显示F10降低线粒体膜电位下降的百分比。表明F10对OGD/R损伤具有明显保护作用。

**3.5.2 PCAF–PGC1α通路介导F10的保护作用**
qPCR结果表明，OGD/R上调线粒体分裂、自噬和凋亡相关基因，同时下调融合和生物合成相关基因。F10预处理可部分逆转这些变化，特别是促进PGC1α、Nrf1和TFAM的表达。通过shRNA分别敲低p300、CBP、PCAF、SIRT1、SIRT7和HDAC5，发现只有敲低PCAF后，F10诱导的PGC1α激活被阻断，且F10的抗凋亡和促生物合成作用消失。这表明F10通过PCAF–PGC1α通路保护心肌细胞。

讨论部分指出，寡糖链长影响其保护效果，聚合度≥4的寡糖（如F4、F10）显示出显著活性，可能因为较长链段能更稳定地结合靶点并延长胞内滞留时间。F10通过促进线粒体生物合成和维持膜电位来保护心肌细胞。此外，由于麦芽寡糖在胃肠道吸收较差，它们可能作为益生元调节肠道菌群，通过肠-心轴产生短链脂肪酸等代谢物，增强肠道完整性和减少全身炎症，从而发挥心脏保护作用，这些推测仍需体内实验验证。

**结论**
通过温和酸水解从红参多糖中分离得到分子量低于3000 Da的寡糖RGP3K。九个由α-(1→4)糖苷键连接的麦芽寡糖同系物（F2–F10）被纯化和结构表征。每个组分均为还原端α和β异头物平衡的混合物。其中，寡糖F10在H9c2心肌细胞中显示出对OGD和OGD/R诱导损伤的保护作用，并增强线粒体功能。机制上，F10通过调节PCAF–PGC1α通路抑制心肌细胞凋亡和改善线粒体功能。此外，本研究存在若干局限性：所有心脏保护评估均为体外实验，需进一步的体内验证；构效关系仅初步探讨，关键结构决定因素仍需确定。本研究为寡糖分离提供了优化策略，展示了所分离寡糖的详细结构解析以及麦芽糖的色谱保留行为。此外，这些发现强调了红参寡糖在OGD和OGD/R损伤心肌细胞模型中的心脏保护功效。这些体外结果具有生理相关性，因为OGD/R模型能忠实再现心肌缺血/再灌注损伤（心肌梗死的重要临床事件）的主要特征。尽管麦芽寡糖在胃肠道吸收较差，但可能通过益生元作用调节肠道菌群并产生短链脂肪酸，从而通过肠-心轴、渐进性肠道水解及增强肠道完整性来减少全身炎症，支持其在心肌保护方面的转化潜力。