胆固醇驱动IFITM3+小胶质细胞激活并诱导STING介导的缺血性卒中后神经炎症

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Cholesterol Drives IFITM3+ Microglia Activation and Induces STING Mediated Neuroinflammation After Ischemic Stroke

　　

目标：脑缺血性卒中触发广泛的神经元膜破裂，释放大量胆固醇，使常驻小胶质细胞不堪重负。小胶质细胞胆固醇代谢失调与卒中后神经炎症有关，但具体的致病性小胶质细胞亚群、其分子特征以及下游炎症级联反应仍不清楚。方法：研究人员采用永久性远端大脑中动脉闭塞（permanent distal middle cerebral artery occlusion, dMCAO）模型结合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）来描绘免疫细胞转录组并鉴定胆固醇相关的小胶质细胞标志物。通过免疫荧光和透射电子显微镜定量胆固醇动态、脂滴积累和炎症标志物表达。治疗干预包括使用2-羟丙基-β-环糊精（2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HβCD）进行药理学胆固醇动员、使用C-176进行药理学STING抑制以及使用AAV9载体进行小胶质细胞靶向STING敲低。在dMCAO、tMCAO和围手术期卒中（perioperative stroke, PIS）模型中，通过梗死体积测量、白质完整性分析和行为学测试（转棒和握力）评估脑损伤和神经功能。结果：通过scRNA-seq，研究人员鉴定出干扰素诱导跨膜蛋白3（interferon-induced transmembrane protein 3, IFITM3）是一个小胶质细胞亚群的特异性标志物，该亚群的特征是ACAT1上调、胆固醇酯化增强以及胆固醇晶体和脂滴积累。这种IFITM3⁺小胶质细胞群在卒中后7天达到峰值，并与NLRP3炎症小体激活和STING信号相关。使用HβCD药理学降低胆固醇负荷可减弱脂滴形成、抑制线粒体DNA泄漏并抑制STING通路激活。相应地，HβCD和C-176给药显著降低了脑梗死体积，减轻了白质脱髓鞘，并改善了dMCAO和tMCAO模型中的运动功能。研究人员进一步发现，AAV介导的STING敲低在HβCD和C-176处理的卒中小鼠中重现了上述保护作用。此外，HβCD治疗改善了PIS模型中的小胶质细胞炎症和功能结局。结论：IFITM3⁺小胶质细胞是一种促炎且富含胆固醇的亚群，加剧了卒中后脑缺血性脑损伤。通过HβCD靶向小胶质细胞胆固醇轴或抑制STING通路是减轻缺血性脑损伤和改善神经功能的一种有前景的治疗策略。

脑缺血性卒中后，神经元膜破裂释放大量胆固醇，导致小胶质细胞胆固醇代谢紊乱，进而引发神经炎症。然而，具体致病性小胶质细胞亚群及其分子机制尚不明确。本研究旨在鉴定这一亚群，并探索胆固醇代谢与STING信号通路在卒中后神经炎症中的作用。研究人员通过dMCAO模型、scRNA-seq、免疫荧光和透射电镜等实验，发现IFITM3⁺小胶质细胞呈现胆固醇酯化增强和脂滴积累，并通过STING通路加剧炎症。药理学干预（HβCD、C-176）和AAV介导的STING敲低均能减轻脑损伤和改善功能。该研究揭示了靶向胆固醇代谢和STING通路的治疗潜力，论文发表在《CNS Neuroscience》。

关键技术方法方面，研究人员使用了以下主要方法：永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）模型（C57BL/6J小鼠，8–10周龄，购自苏州赛业生物）；单细胞RNA测序（scRNA-seq，PanoCell平台，由NovelBio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.完成）；免疫荧光染色（包括Filipin III、BODIPY 493/503、偏振光显微镜）和透射电子显微镜（TEM）用于脂质和超微结构分析；药理学干预包括胆固醇动员剂HβCD（400 mg/kg，腹腔注射）和STING抑制剂C-176（10 mg/kg，腹腔注射）；小胶质细胞靶向STING敲低使用AAV9-F4/80-miR30-shRNA载体（侧脑室注射）；行为学评估包括转棒测试和握力测试；模型还包括tMCAO（短暂大脑中动脉闭塞）和PIS（围手术期卒中，先进行回结肠切除术，24 h后dMCAO）。

研究结果如下：

3.1 胆固醇在脑缺血性卒中后在促炎性小胶质细胞中积累：通过Filipin III染色和偏振光显微镜，研究人员发现dMCAO后小胶质细胞内游离胆固醇和胆固醇晶体进行性积累，在7天达峰；BODIPY染色显示中性脂滴显著增加，且约90%含胆固醇晶体的小胶质细胞同时富含BODIPY⁺脂滴，并伴随NLRP3表达上调，表明胆固醇积累与促炎活化相关。

3.2 Ifitm3鉴定出具有增强胆固醇酯化和脂滴积累的小胶质细胞：scRNA-seq分析显示，Ifitm3在缺血后特定小胶质细胞亚群中显著上调，该亚群同时高表达Acat1（胆固醇酯化关键酶）。免疫荧光和偏振光显微镜证实，IFITM3⁺小胶质细胞特异性富集胆固醇晶体和PLIN2⁺中性脂滴，表明IFITM3是胆固醇代谢紊乱小胶质细胞的标志物，其比例在7天达峰并持续至28天。

3.3 HβCD减轻缺血性卒中后IFITM3⁺小胶质细胞负荷和胆固醇酯化：HβCD（胆固醇动员剂）处理显著降低dMCAO小鼠小胶质细胞内游离胆固醇、IFITM3⁺细胞比例、ACAT1⁺细胞比例、BODIPY⁺脂滴和TEM可见的脂滴数量，并减少NLRP3⁺小胶质细胞，表明HβCD通过动员胆固醇减轻了代谢应激和神经炎症。

3.4 HβCD介导的胆固醇清除减轻缺血性脑损伤并促进功能恢复：HβCD处理组7天时MAP2/IgG染色显示的梗死体积显著减小，SMI32/MBP比值降低（提示白质损伤减轻），TEM显示G-比值降低（轴突髓鞘保存），且握力和转棒性能在3和7天均改善。tMCAO模型中也验证了HβCD的神经保护作用，包括梗死体积减小和LFB染色显示髓鞘保留。

3.5 治疗性抑制STING重现HβCD介导的神经保护：HβCD处理抑制了STING⁺小胶质细胞增加和线粒体DNA（mtDNA）泄漏（TOM20⁺dsDNA⁺面积减少）。STING抑制剂C-176显著减少梗死体积，与HβCD联用无叠加效应，且行为学、SMI32/MBP比值改善类似。AAV9介导的小胶质细胞STING敲低（AAV-shSTING）也减少了IFITM3⁺和ACAT1⁺小胶质细胞，表明STING是胆固醇积累下游的关键炎症介质。

3.6 HβCD治疗改善围手术期卒中（PIS）后的神经炎症和结局：在PIS模型中，HβCD处理显著减少PLIN2⁺脂滴小胶质细胞和NLRP3⁺小胶质细胞，减小梗死体积，并降低SMI32/MBP比值，表明HβCD在更复杂的临床相关模型中同样有效。

讨论部分总结：本研究鉴定出IFITM3⁺小胶质细胞为卒中后胆固醇酯化异常、脂滴积累和胆固醇晶体沉积的致病亚群，该亚群与线粒体功能障碍、STING通路激活和持续神经炎症相关。通过HβCD动员胆固醇或抑制STING信号可减轻脑损伤和神经功能缺损。研究结论翻译如下：总之，本研究为卒中后IFITM3⁺小胶质细胞异常胆固醇酯化导致胆固醇晶体积累和STING依赖性神经炎症这一独特致病机制提供了证据。药理学和遗传学操作表明胆固醇代谢与STING信号间存在因果联系，但尚需更严格的遗传修饰和靶向消融实验来巩固因果机制并推动转化研究。这些发现提示，靶向IFITM3⁺小胶质细胞及其胆固醇晶体负荷可能是减轻脑缺血性卒中后神经炎症和神经功能缺损的潜在治疗策略，需要进一步机制研究以确立因果关系。