新生儿Fc受体在维持人类及其他哺乳动物体内循环中的免疫球蛋白G抗体浓度方面起着至关重要的作用。这种稳态调节是通过一种回收机制实现的：抗体首先通过胞饮作用被非特异性地吸收到液相中，随后在酸化的早期内体中，FcRn会与抗体的可结晶Fc区域结合[1]。IgG-FcRn复合物会被运输回细胞表面，由于血清pH值较低，该复合物会解离，从而使抗体重新回到血液循环中，同时释放出FcRn以便再次使用[1]。这种依赖于pH值的与FcRn的结合使得IgG抗体的血清半衰期延长至大约三周，而其他抗体亚型的半衰期仅为5-7天[2]。除了控制IgG抗体浓度外，FcRn还有其他多种功能，包括在胎盘中将IgG从母体循环转运到胎儿循环中，以及帮助婴儿的胃肠道上皮吸收母乳中的IgG，其名称也正是由此而来[1, 3, 4, 5]。
近几十年来，许多研究致力于通过改造Fc区域来提高IgG的半衰期，方法是增强其在内体中与FcRn的结合亲和力[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]。目前已有的改良型Fc区域可将IgG的半衰期延长约2到6倍，但如果能进一步优化以实现更大幅度的半衰期延长，或许能提升抗体在预防性及其他长期应用中的效用。尽管在制备具有不同结合亲和力的Fc变体方面已经取得了显著进展，但目前性能最好的那些Fc变体都是通过实验筛选和分选技术发现的，可能在实现最大化的pH依赖性结合、从而延长抗体半衰期方面并非最优选择。理想的情况是，这类Fc变体能在早期内体酸性pH值（约6.0）时与FcRn形成极高亲和力的结合，而在pH值为7.4时又能完全释放回血清中。因此，目前的挑战在于设计出那些在这一pH范围内FcRn结合特性有显著差异的抗体。不过，考虑到质子化状态以及pH敏感性，这对基于结构的合理设计工作来说是一个巨大障碍，因为目前的计算筛选方法通常是基于经验进行拟合或训练的，并没有将这些特征纳入考量。
我们研究了运用计算方法，尤其是自由能扰动法，来评估其是否能够帮助合理设计出能够延长抗体半衰期的Fc变体，使其超越现有变体的表现。自由能扰动法包括带有全原子显式溶剂的环境下的分子动力学模拟，用来模拟两种密切相关的分子物种之间的转变——在本研究中，就是两种氨基酸侧链之间的转变。我们采用了名为FEP+的自由能扰动法实现工具（由Schr?dinger公司开发），该工具已在多种系统及不同类型的扰动场景下成功预测了自由能变化，应用场景包括蛋白质-蛋白质结合中的残基突变，以及其他应用，如小分子配体-受体结合、蛋白质稳定性以及蛋白质残基的pKa值计算[16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]。
在本研究中，我们结合实验测量结果与计算建模，采用图1所示的迭代方法来研究突变对Fc-FcRn结合亲和力的影响。我们首先收集了大量关于Fc及FcRn变体的已有结合亲和力数据，将这些文献数据与新测得的结合数据结合起来。与此同时，我们基于高分辨率晶体结构构建了Fc-FcRn复合物的全原子模型，并通过基于自由能扰动法的pKa计算为关键可电离残基确定了质子化状态。这些实验与结构数据为回顾性评估蛋白质-蛋白质结合自由能预测结果提供了基础。
接下来，我们利用自由能扰动法计算整个数据集中突变对结合自由能的影响，并系统地分析那些计算预测结果与实验数据不一致的案例。我们并没有将这些差异视为孤立的失败，而是将其作为找出计算方法或结构模型中错误根源的依据，进而指导工作流程的迭代改进。我们分析了可能导致预测误差的三个潜在因素。首先，我们研究了突变与决定Fc-FcRn结合pH依赖性的关键pH感应组氨酸残基之间的耦合效应，为此进行了额外的自由能扰动法计算，明确考虑了这些组氨酸在不同质子化状态下的能量贡献以及它们与附近突变的相互作用[19, 22, 23]。其次，我们通过测定未结合状态下Fc变体的新晶体结构，并运用模态分析及分子动力学模拟分析大尺度结构域运动，来探究Fc在结合态与未结合态之间的构象差异是否会导致预测误差。第三，我们通过评估选定变体的不同侧链构象以及不同的结构起始模型，来考察局部构象采样限制是否会影响单个自由能扰动法预测的结果。总体而言，这些分析为我们识别并解决初始模型及默认自由能扰动法流程中的局限性提供了框架。
这种工作流程使得我们能够不断迭代改进计算流程，同时还将预测精度与系统中特定的分子特征联系起来。从更广泛的角度来看，这项研究展示了如何将自由能计算、结构生物学以及实验结合测量相结合，从而提升对pH依赖性蛋白质-蛋白质相互作用的预测能力。
