磷酸抗原驱动的嗜乳脂蛋白寡聚体解离激活γδ T细胞

《Cell Discovery》：Phosphoantigen-driven dissociation of butyrophilin oligomers activates γδ T cells

　　

摘要翻译
γδ T细胞代表了癌症免疫治疗的一个有前景的途径。Vγ9Vδ2 T细胞受体（TCR），由γδ T细胞的主要亚群表达，对多种癌细胞上磷酸抗原（pAg）结合的嗜乳脂蛋白（BTN）作出反应。然而，pAg介导的Vγ9Vδ2 TCR激活的分子机制仍存在争议。在本研究中，研究人员采用整合方法阐明Vγ9Vδ2 T细胞中pAg反应性的机制。研究结果表明，BTN在缺乏pAg时形成高阶寡聚体。当pAg结合时，这些高阶寡聚体解离为独立的四聚体，使Vγ9Vδ2 TCR能够结合。这种pAg诱导的BTN高阶寡聚体解离对于pAg介导的γδ T细胞激活至关重要。研究人员的发现揭示了一种BTN高阶寡聚体解离驱动的pAg感应机制，为未来的免疫治疗策略提供了有价值的见解。

论文解读文章

**研究背景与问题**

γδ T细胞是一类能够识别并杀伤肿瘤的独特免疫细胞，与依赖主要组织相容性复合体（MHC）呈递新抗原肽的αβ T细胞不同，γδ T细胞能以MHC非依赖方式识别多种配体，在MHC表达下调且突变负荷较低的恶性肿瘤如胰腺腺癌中具有独特优势。在人类中，Vγ9Vδ2 T细胞是循环γδ T细胞的主要亚群，占血液总T细胞的1%–5%，在细菌和寄生虫感染期间可扩增至循环T细胞的50%。Vγ9Vδ2 T细胞通过裂解肿瘤细胞、产生细胞因子和趋化因子以及抗原呈递等效应功能发挥抗肿瘤作用。Vγ9Vδ2 T细胞由称为磷酸抗原（pAg）的小分子非肽类磷酸化代谢物激活，这些pAg由微生物通过非甲羟戊酸途径产生如（E）-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸（HMBPP），或由人类细胞通过甲羟戊酸途径产生如异戊烯焦磷酸（IPP）。在肿瘤微环境中，甲羟戊酸途径失调导致IPP积累，触发Vγ9Vδ2 T细胞激活。pAg对Vγ9Vδ2 T细胞的激活依赖于BTN3A1和BTN2A1分子，且BTN3A2或BTN3A3对pAg反应至关重要。BTN2A1、BTN3A1和BTN3A3具有相似的胞外区结构，包括IgG样可变（IgV）域和恒定（IgC）域，以及跨膜（TM）域、近膜（JM）域和胞内B30.2域。已有研究提出两种pAg介导T细胞激活模型：“钳状抓取”机制和pAg促进BTN2A1与BTN3A1二聚化形成四聚体复合物的模型。然而，pAg介导Vγ9Vδ2 T细胞激活的分子机制仍存在争议，本研究旨在阐明这一机制。

**研究内容与结论**

研究人员采用哺乳动物共表达系统重构包含BTN2A1、BTN3A1以及BTN3A2或BTN3A3的全长膜结合BTN复合物，该体系保留了BTN装配的天然构象，比使用胞外域的研究更生理相关。通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析了全长BTN分子的系列结构，结合生化、生物物理和细胞分析，研究人员证明了BTN分子在细胞膜上组装成高阶寡聚体。pAg结合触发这些寡聚体解离为四聚体，促进Vγ9Vδ2 TCR结合并激活T细胞。研究表明，BTN高阶寡聚体的解离是pAg感应和γδ T细胞激活的关键步骤，为免疫治疗提供了新见解。该论文发表在《Cell Discovery》。

**主要技术方法**

研究人员使用了多种关键技术：cryo-EM用于解析BTN复合物结构；分析超速离心（AUC）检测溶液中的寡聚化状态；全内反射荧光结构照明显微镜（TIRF-SIM）观察细胞膜上的寡聚体形态；荧光寿命成像结合荧光共振能量转移（FLIM-FRET）评估膜上分子间相互作用；表面等离子体共振（SPR）测定结合亲和力；T细胞功能实验包括共培养和流式细胞术。样本队列来源包括人类外周血单核细胞（PBMCs）和多种细胞系如K562、HEK293T、HeLa、RPMI8226等。

**研究结果**

**BTN分子在无pAg时形成高阶寡聚体**：通过cryo-EM和AUC分析，研究人员发现3A2复合物（BTN2A1/3A1/3A2）和3A3复合物（BTN2A1/3A1/3A3）在无HMBPP时形成高阶寡聚体，由多个四聚体单元并排排列。TIRF-SIM成像显示野生型（WT）3A2复合物在细胞膜上形成线状细丝簇，长度约100–1000 nm，对应8–80个四聚体单元。Y127A突变破坏IgVBTN2A1–IgVBTN3A1界面，显著减少寡聚体形成，表明该界面对寡聚化至关重要。

**pAg驱动BTN高阶寡聚体解离**：在HMBPP存在下，cryo-EM结构显示3A2和3A3复合物采用四聚体构象，呈剪刀状。与无pAg时的结构比较，pAg结合诱导胞外区弯曲和胞内区空间冲突，导致寡聚体不稳定并解离为四聚体。AUC实验证实HMBPP减少了高分子量物种的比例。FLIM-FRET和TIRF-SIM实验显示pAg处理显著降低FRET信号和细丝长度，表明pAg诱导寡聚体解离。CCC突变锁定寡聚体状态后pAg无法诱导解离。

**Vγ9Vδ2 TCR与BTN四聚体的结合不依赖pAg**：通过cryo-EM解析了G115 TCR–3A2、MOP TCR–3A2和G115 TCR–3A3复合物结构，显示双配体识别模式，Vγ9链与IgVBTN2A1结合，Vδ2链与IgVBTN3A2结合。SPR实验表明WT和AAR复合物在有无pAg时与TCR的结合亲和力相似，说明pAg不影响TCR与BTN四聚体的直接结合。

**pAg驱动细胞膜上Vγ9Vδ2 TCR与BTN结合**：TCR四聚体染色实验显示，pAg处理增强WT 3A2复合物表达细胞上的TCR结合，但AAR复合物（pAg结合受损）无此效应。Y127A复合物（组成型四聚体）在无pAg时显示高TCR结合水平。CCC突变锁定寡聚体后，TCR结合被抑制，还原剂BME处理恢复结合，证明寡聚体解离是TCR结合的必要条件。

**BTN高阶寡聚体解离贡献于pAg依赖性γδ T细胞激活**：共培养实验显示，3A2复合物表达细胞诱导Vγ9Vδ2 T细胞CD25上调和IFN-γ分泌，pAg处理增强反应。AAR复合物消除pAg依赖性激活，Y127A复合物降低激活水平。在K562细胞中，BTN3A1敲除消除pAg反应，回补WT BTN3A1恢复激活，而Y127A和ΔV突变显著降低激活。

**原位验证pAg诱导的BTN高阶寡聚体解离**：Duolink?邻近连接试验（PLA）在K562细胞中显示，pAg处理显著降低BTN3A的PLA信号，表明内源性BTN寡聚体在pAg刺激下解离，验证了该机制在人类细胞中的生理相关性。

**讨论与结论**

本研究提出一个pAg依赖性γδ T细胞激活的新模型：在无pAg时，BTN分子形成高阶寡聚体，胞外域紧密排列封闭TCR结合位点；pAg结合后，寡聚体解离为四聚体，暴露TCR结合界面，启动激活。该模型解释了pAg浓度依赖性的激活阈值，内源性IPP需要较高浓度，而微生物HMBPP在亚纳摩尔水平即可激活。研究还发现BTN寡聚化状态调节TCR结合的可及性，突变破坏寡聚体界面可增强基础激活。研究整合结构、生化和细胞数据，揭示了pAg调控BTN组装动态的早期步骤，与现有模型互补。这些发现为基于γδ T细胞的癌症免疫治疗提供了新思路，如设计pAg前体药物或T细胞接合器（TCEs）来触发BTN寡聚体解离并引导T细胞靶向肿瘤。研究也指出不同细胞系统和物种间BTN信号传导的差异，需进一步验证，但BTN复合物的基本生化特性可能保守，为下一代免疫治疗设计提供原则。