《Neurochemistry International》：A new method for the production of recombinant human Aβ(1-42) peptide
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背景：淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中发挥核心作用。化学合成的Aβ(1–42)是AD机制研究和药物筛选中最广泛使用的资源。然而，固相合成会引入截短和修饰的副产物，导致批次间异质性和实验可重复性受损。方法：研究人员在此建立了一种优化的重组表达
背景：淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中发挥核心作用。化学合成的Aβ(1–42)是AD机制研究和药物筛选中最广泛使用的资源。然而，固相合成会引入截短和修饰的副产物，导致批次间异质性和实验可重复性受损。方法：研究人员在此建立了一种优化的重组表达系统，利用热绿蛋白（TGP）融合标签结合烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶位点特异性切割，在大肠杆菌中生产无标签的、真实的人Aβ(1–42)。研究人员系统性地进行了并排生物物理表征，包括二级结构转变和淀粉样蛋白聚集动力学，以比较纯化的重组Aβ(1–42)（RecAβ）和常规合成Aβ(1–42)（SynAβ）。进一步应用人诱导多能干细胞来源的神经元（iNs）和原代小鼠小胶质细胞来评估和比较其神经毒性和小胶质细胞调节功能。结果：优化的TGP–TEV平台能够稳健地生产高纯度RecAβ(1–42)，每升细菌培养物可获得6–7 mg完整肽。生物物理分析表明，RecAβ与SynAβ具有高度保守的二级结构特征，但表现出显著增强的聚集倾向。功能分析显示，RecAβ和SynAβ来源的ADDLs在人iNs中具有等效的神经毒性。虽然两种纤维制剂表现出相当的小胶质细胞结合识别和溶酶体清除动力学，仅存在细微的时间差异，但RecAβ纤维比SynAβ纤维诱导更严重的小胶质细胞吞噬溶酶体功能障碍。结论：这项工作建立了一种稳健、可重复的重组策略，用于生成真实的人Aβ(1–42)。RecAβ再现了商业SynAβ的核心AD相关生物活性，同时具有更强的聚集能力和增强的破坏小胶质细胞稳态功能的能力。这种标准化的重组Aβ制剂为Aβ生物学研究和AD治疗候选药物的筛选提供了有用工具。
**重组人Aβ(1-42)肽生产方法及其生物活性研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理特征之一是脑内淀粉样蛋白-β（amyloid-β protein, Aβ）的异常聚集。大量研究证据表明，Aβ在脑内的积聚是AD发病机制中的起始事件，可触发突触功能障碍、tau蛋白过度磷酸化和不可逆的神经元变性等一系列神经毒性级联反应。尽管靶向Aβ的单克隆抗体已成为首批成功转化至临床实践的AD疾病修饰疗法，但其治疗价值受到认知改善有限和治疗成本高昂的限制。因此，深入解析疾病相关Aβ聚集体的结构特征，对于推进下一代AD治疗药物的合理设计至关重要。
在AD机制研究中，通过固相肽合成法（solid-phase peptide synthesis, SPPS）生产的合成Aβ(1–42)（SynAβ）是最广泛使用的实验试剂。然而，SPPS存在固有的技术缺陷：Aβ(1–42)的高度疏水性促进了树脂结合肽链之间的聚集以及链内聚集，导致9-芴甲氧羰基（Fmoc）合成过程中的脱保护率降低和重复性不完全偶联反应。由此产生的截短或修饰产物（如Aβ42Δ39和Aβ42-His）是主要的污染物，能够减弱纤维形成和细胞毒性。这些序列缺失或修饰的肽段在长度和组成上各不相同，即使经过严格的反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，也难以与目标产物完全分离，导致批次间变异和实验可重复性受损。
为克服合成肽的上述局限，研究人员尝试在大肠杆菌中重组生产Aβ(1–42)，常采用谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、泛素和小泛素样修饰物（SUMO）等融合标签系统。然而，这些方法要么产量低且需要大量优化，要么产生保留融合标签或额外N-端甲硫氨酸的非真实Aβ种类。虽有研究采用泛素水解酶-1、肠激酶或TEV蛋白酶切割策略生产了无额外标签的真实Aβ肽，但这些重组Aβ(1–42)制剂相对于合成对应物的聚集行为和毒性在许多情况下仍未得到充分表征。已有研究结果存在争议：有的显示重组Aβ(1–42)的毒性与化学合成肽相似，有的则表明重组Aβ(1–42)比合成制剂更均匀、更快速地形成纤维，并表现出显著更高的神经毒性。因此，重组Aβ(1–42)是否能忠实再现常用合成制剂的生化特性和疾病相关活性仍存在争议。
基于上述问题，本研究旨在建立一种高效、稳健的重组人Aβ(1–42)生产方法，并系统比较重组Aβ(1–42)（RecAβ）与商业合成Aβ(1–42)（SynAβ）在生物物理特性、神经毒性和小胶质细胞功能调节方面的异同。
**二、主要技术方法**
研究人员采用了以下关键实验技术：（1）构建pET21a-His标签-TGP-TEV-Aβ(1–42)融合表达质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达；（2）通过Ni-NTA亲和层析在变性条件下纯化融合蛋白，结合内毒素去除柱处理；（3）利用TEV蛋白酶进行位点特异性切割释放目标肽段，经两轮分子筛层析（SEC）纯化获得高纯度Aβ(1–42)；（4）采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）验证肽段分子量和纯度；（5）圆二色光谱（CD）监测二级结构转变；（6）硫黄素T（ThT）连续荧光测定分析聚集动力学；（7）人iPSC来源神经元（iNs）培养体系用于神经毒性评价；（8）原代小鼠小胶质细胞（分离自P0–P3 C57BL/6J乳鼠）培养体系用于吞噬和溶酶体功能分析；（9）原子力显微镜（AFM）表征纤维形态；（10）流式细胞术分析小胶质细胞吞噬功能。
**三、研究结果**
**（一）TGP–Aβ融合蛋白的表达、纯化与TEV切割**
融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达，占总细胞蛋白的30%以上。SDS-PAGE分析显示超过一半的表达蛋白存在于不溶性组分中，主要以包涵体形式积累。在变性条件下纯化获得每升培养物约80–90 mg融合蛋白。通过系统优化TEV蛋白酶裂解条件，确定TED缓冲液（含1 M尿素）和底物与酶比例≤6 μg/单位可获得最大切割效率（>70%）。
**（二）重组Aβ(1–42)的纯化与表征**
经两轮SEC纯化后，获得每升细菌培养物6–7 mg高纯度重组Aβ(1–42)。高分辨率LC-MS确认纯化肽段的单同位素分子质量为4511.33 Da，与Aβ(1–42)的理论分子量一致。HPLC和LC-MS平行分析证实了两种肽制剂的高纯度（>95%）。值得注意的是，CBB染色中观察到的约14 kDa条带经高灵敏度Western blot分析未被检测到，表明其为SDS诱导的寡聚体假象而非样品异质性。
**（三）重组Aβ(1–42)表现出比合成Aβ(1–42)更强的聚集倾向**
CD光谱显示RecAβ和SynAβ在孵育过程中均经历从无规卷曲到β-折叠富集构象的转变，表明两种制剂的二级结构转化总体相当。ThT荧光聚集动力学实验表明，在所有测试浓度下，RecAβ均表现出比SynAβ更快的聚集动力学，在5 μM和10 μM浓度下差异达到统计学显著性。这些结果证明重组Aβ(1–42)具有比商业合成Aβ(1–42)更强的聚集倾向。
**（四）重组和合成Aβ(1–42)来源的ADDLs在人iPSC来源神经元中具有等效神经毒性**
寡聚体选择性免疫分析确认两种制剂来源的ADDLs具有相当的寡聚体产量。在功能实验中，RecAβ-ADDLs和SynAβ-ADDLs处理均诱导人iNs出现显著的神经突变性，包括神经突长度减少约30%和25%、广泛的神经突串珠样变、局灶性肿胀和营养不良性神经突形成。定量分析证实两种ADDLs制剂在神经突退行性变指数和肿胀结构数量方面无统计学差异，表明它们在体外具有等效的神经毒性。
**（五）小胶质细胞对RecAβ和SynAβ纤维的结合和降解大体相当，仅存在细微动力学差异**
AFM确认两种纤维制剂均具有丰富的纤维形态。纤维形成效率定量分析显示两种制剂具有相当的沉淀效率。在原代小鼠小胶质细胞实验中，RecAβ和SynAβ纤维在第1天表现出相当的细胞结合水平，随后在4天孵育期间均呈现时间依赖性清除。值得注意的是，RecAβ纤维在第2天表现出显著较低的清除效率，提示其对小胶质细胞降解具有轻微更强的抵抗性。
**（六）RecAβ纤维比SynAβ纤维诱导更显著的小胶质细胞吞噬-溶酶体功能障碍**
流式细胞术和荧光成像分析显示，两种纤维处理均增强了小胶质细胞的吞噬活性，其中RecAβ处理组表现出显著更高的吞噬珠负荷。溶酶体酸化分析显示，两种纤维暴露均显著降低了酸性溶酶体区室的面积，RecAβ纤维引起的溶酶体去酸化程度略大于SynAβ纤维，但差异未达统计学显著性。这些结果表明，两种纤维均能诱导小胶质细胞过度吞噬伴随溶酶体去酸化，而RecAβ纤维倾向于诱导更严重的小胶质细胞功能损害。
**四、讨论与结论**
本研究建立了一种基于TGP融合标签和TEV蛋白酶切割的稳健、高产量、可重复的重组Aβ(1–42)生产平台。在严格控制的条件下，通过GuHCl变性和SEC分离获得均匀的单体组分后，CD光谱显示RecAβ和SynAβ具有高度保守的二级结构转变特征，但ThT聚集实验揭示了两种制剂之间明显的动力学差异。RecAβ的聚集动力学更快，特别是在生理相关的低浓度（5–10 μM）下更为显著。SynAβ相对较弱的聚集倾向可能归因于合成过程中残留的截短产物（如Aβ42Δ39），这些杂质在标准RP-HPLC纯化后仍存在，对Aβ的成核和纤维延伸具有抑制作用。
在功能层面，尽管RecAβ的纤维化动力学增强，但RecAβ和SynAβ来源的ADDLs在人iNs中表现出等效的神经毒性，表明重组Aβ(1–42)形成神经毒性可溶性寡聚体组装体的能力与合成Aβ(1–42)相同。小胶质细胞功能实验揭示了两种纤维制剂之间的微妙但生物学相关的差异：两种制剂的纤维化效率、小胶质细胞结合亲和力和时间依赖性清除动力学大体相当，但RecAβ纤维诱导了更严重的小胶质细胞功能损害，表现为显著更高的吞噬珠负荷和更强的溶酶体功能障碍趋势。
综上所述，本研究通过并排功能验证证明，RecAβ再现了常规SynAβ的关键神经毒性和小胶质细胞调节活性，同时表现出增强的聚集倾向和更强的破坏小胶质细胞溶酶体功能的能力。这些观察结果解决了先前研究中关于Aβ生物活性差异的长期争议，阐明了Aβ(1–42)的制备依赖性功能差异，并为未来AD机制研究和药物筛选提供了标准化肽资源。
