人类前额叶皮层上层抑制性中间神经元组织的区域特化

《Journal of Anatomy》：Regional specialization of upper-layer inhibitory interneuron organization in the human prefrontal cortex

　　

摘要翻译：GABA能中间神经元在塑造皮层微环路功能中发挥核心作用，然而人类前额叶皮层不同亚区中主要中间神经元群体的解剖学组织仍缺乏系统表征。本研究考察了人类前额叶皮层背侧（Brodmann 9区）和腹侧（Brodmann 14r区）主要GABA能中间神经元群体的分层分布和区域组织。研究人员分析了来自五名典型成年男性大脑的死后人类前额叶皮层组织，使用以下分子标记物：钙网膜蛋白（calretinin，CR）、小清蛋白（parvalbumin，PV）、钙结合蛋白（calbindin，CB）和生长抑素（somatostatin，SOM）。采用双标记免疫荧光法评估不同GABA能中间神经元群体之间的重叠，并使用RNAscope原位杂交技术确认其神经递质表型。所有被分析的群体均表现出GABA能分子表型。CR+神经元在两个被分析的皮层区域中构成最大的中间神经元群体，并表现出显著的颗粒上层富集。CB+神经元也集中分布于皮层上层，并频繁与SOM共表达。相比之下，PV+神经元集中于第III–IV层，而SOM+神经元在第II–VI层分布较为均匀。主要的区域差异是BA14r中CR+神经元比例显著高于BA9（占所有神经元的10.24%对8.21%；p=0.0248），而探索性分析进一步表明CR/PV比值升高和PV/SOM比值降低。这些差异主要由颗粒上层中间神经元组成的变异驱动，而颗粒下层组织在两个皮层区域之间保持相对相似。这些发现支持人类前额叶皮层抑制性中间神经元组织的区域特异性特化，并提示颗粒上层抑制性环路的差异可能有助于背侧和腹侧前额叶皮层-皮层网络的独特功能架构。

论文解读

一、研究背景与目的

大脑皮层GABA能中间神经元是高度异质性的细胞群体，在调控神经网络活动和介导主神经元间相互作用中发挥关键作用。皮层功能的协调与整合不仅依赖于GABA能神经元的总体比例，还取决于其多样性。长期以来，钙结合蛋白——钙结合蛋白（calbindin，CB）、钙网膜蛋白（calretinin，CR）和小清蛋白（parvalbumin，PV）的免疫组织化学检测被广泛用于定义灵长类皮层GABA能神经元的主要类别。超过80%的皮层GABA能神经元表达这三种标记物之一，且它们之间的重叠极小。大多数CB+神经元共表达神经肽生长抑素（somatostatin，SOM），这种部分重叠凸显了经典标记物分类的局限性，提示在定义中间神经元亚型时需要考虑联合标记物表达。PV+、SOM+和CR+神经元合计估计占灵长类皮层GABA能神经元的90%以上。

尽管转录组学方法取得了进展，免疫组织化学在人类死后组织研究中仍是不可或缺的工具，因为它能直接揭示神经元形态、分层分布和连接模式。单核RNA测序研究已证明主要亚类水平上细胞组成基本一致，但也识别出特定中间神经元群体比例的喙-尾梯度。然而，人类前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）不同亚区中这些中间神经元群体的分层组织的定量数据仍然稀缺。背外侧PFC主要与高级认知过程相关，而眶内侧PFC更密切关联情绪和社会行为，这两个区域在连接模式上存在显著差异，提示其中间神经元组成和组织也可能不同。理解这些潜在差异对于解释前额叶环路的功能特化及其在神经精神疾病中的易感性至关重要。本研究旨在确定背外侧和眶内侧PFC亚区中主要GABA能中间神经元群体的组成和分层分布是否存在差异。

二、技术方法概述

研究人员分析了来自五名男性受试者（死亡年龄29至51岁，死后间隔6至11小时）的大脑样本，这些样本来自萨格勒布神经胚胎学收藏（Zagreb Neuroembryological Collection）。组织块按照Talairach坐标切取，分别包含背外侧PFC的额上回（Brodmann 9区，BA9）和眶内侧PFC的直回（Brodmann 14r区，BA14r）。主要技术方法包括：双标记免疫荧光法，使用CR、PV、CB和SOM抗体结合NeuN标记进行多重标记；RNAscope原位杂交技术，检测SLC17A7、SLC32A1、GAD1和GAD2 mRNA以验证神经递质表型；激光共聚焦显微镜成像和Neurolucida系统定量分析，对每个皮层区域每个大脑三个组织切片进行系统间隔采样，以NeuN+细胞总数为分母计算标记阳性细胞比例。

三、研究结果

3.1 标记定义细胞群体的GABA能谱系

通过RNAscope原位杂交与CR、PV、CB和SOM免疫标记的系统性定性分析证实，所有四种标记定义的细胞群体均呈GABA能表型。SLC17A7 mRNA（编码囊泡谷氨酸转运体1，VGLUT1）和SLC32A1 mRNA（编码囊泡GABA转运体，VGAT）在单独的细胞轮廓中被检测到，未观察到两种转录本的细胞共表达。所有遇到的CR+、PV+、CB+和SOM+细胞轮廓均共表达SLC32A1 mRNA，而未观察到与SLC17A7 mRNA的共定位。此外，绝大多数标记阳性细胞轮廓同时表达GAD1和GAD2 mRNA，每个标记阳性细胞至少表达其中一种转录本，进一步验证了GABA能表型。

3.2 中间神经元群体的共表达

双标记免疫荧光实验证实，CR+和PV+细胞与其他标记物几乎无共表达，构成独立的中间神经元群体。CB+和SOM+细胞群体之间存在显著重叠：约68%的CB+细胞共表达SOM，约50%的SOM+细胞共表达CB。共表达呈强层依赖性：第II层和第III层中80%和72%的SOM+细胞共表达CB，而在第IV层下降至8%，第V层下降至3%。这定义了三个不同的亚群：CB+SOM+、CB+SOM?和CB?SOM+，从而确定了三种基本不重叠的中间神经元群体——CR+细胞、PV+细胞和CB∪SOM细胞。

3.3 PFC中间神经元群体的分层分布

CR+细胞在BA9中平均占神经元总数的8.21%，在BA14r中占10.24%，在第I层最为丰富（BA9中23.24%，BA14r中32.02%），随皮层深度逐渐减少。PV+细胞占BA9神经元的7.14%和BA14r的6.33%，在第IV层最为丰富（BA9中9.74%，BA14r中10.02%），其纤维形成围绕锥体细胞体的致密周体丛。CB+细胞是最不丰富的中间神经元群体，占BA9神经元的4.73%和BA14r的5.02%，在第II层比例最高。SOM+细胞占BA9神经元的6.38%和BA14r的7.28%，在第II–VI层分布相对均匀。在颗粒上层，CR+细胞是最丰富的中间神经元群体，其次是CB+细胞；在颗粒下层，SOM+细胞最为丰富，CR+细胞最少。CR+和CB+细胞在颗粒上层和颗粒下层之间的比例差异具有统计学显著性（两者p<0.0001），而PV+和SOM+细胞无显著差异。

3.4 中间神经元分布的区域差异

BA14r中CR+细胞比例在所有五个大脑中均持续高于BA9（10.24%对8.21%），平均配对差异为2.03个百分点（95%CI，0.42–3.63；配对t检验，t(4)=3.50，p=0.0248，偏η2=0.754）。这种增加由所有层中小的、一致的增加驱动，在颗粒上层最为显著。CR/PV比值在BA14r中显著更高，反映CR+细胞比例增加和PV+细胞比例降低的组合效应；PV/SOM比值在BA14r中持续更低。估计的标记细胞总百分比在BA9中为22.95%，在BA14r中为25.36%，颗粒上层明显高于颗粒下层。

四、讨论与结论

本研究的主要发现是：人类PFC背侧（BA9）和腹侧（BA14r）在主要GABA能中间神经元群体的组成和分层组织上存在差异。BA14r中CR+神经元比例显著高于BA9，且CR/PV和PV/SOM比值存在显著区域差异。这些区域差异主要归因于颗粒上层皮层组织的差异，两个区域中CR+神经元在皮层上层（I–III层）是最丰富的中间神经元群体，但这种优势在BA14r中尤为突出。相比之下，颗粒下层（V–VI层）所有被分析中间神经元群体的分布更为均匀。标记神经元比例约占NeuN+总群体的四分之一，与灵长类先前的定量免疫组织化学研究一致。

研究结论：人类前额叶皮层背侧和腹侧亚区在抑制性中间神经元组织上存在区域特异性特化，颗粒上层抑制性环路的差异可能构成背侧和腹侧前额叶皮层-皮层网络不同功能架构的基础。这些发现为理解前额叶皮层环路的区域特异性组织及其在神经精神疾病中的选择性易感性提供了重要的结构基础。