水稻（Oryza sativa L.）是一种重要的粮食作物，养活了全球一半以上的人口，在保障粮食安全方面起着关键作用[1]。然而，种子传播的细菌病原体对水稻生产和国际种子贸易构成了严重威胁，因为它们会导致疾病长距离传播，并增加检疫工作的难度。这些病原体会影响种子的质量、发芽率以及作物产量，从而造成巨大的经济损失[2]。其中，由Xanthomonas oryzae pv. oryzicola、Burkholderia glumae和B. gladioli分别引起的叶斑病、穗枯病和鞘腐病等细菌性疾病，带来了重大的生物安全与检疫风险，因此亟需快速准确的诊断工具[3]。
X. oryzae pv. oryzicola会引发细菌性叶斑病，这种病害的特征是叶片叶脉间出现坏死病灶，尤其在热带和亚热带水稻种植区，可导致高达32%的产量损失。该病原体可通过种子传播，在适宜的环境条件下会迅速扩散[4]。B. glumae则是细菌性穗枯病的主要致病菌，这种病害会在水稻的生殖期发作，导致谷粒变色、不育以及产量大幅下降。该病原体在亚洲、非洲以及北美和南美的许多水稻生产国都构成了严重威胁[5]。B. gladioli则会导致水稻出现鞘腐病和谷粒变色，还可能引发穗枯病症状。这种病原体常常与B. glumae共同存在于同一生态环境中，使得田间诊断和病害管理更加困难[6]。这些病原体不仅会降低谷物的产量和质量，还会带来严重的植物检疫和生物安全问题，因为它们能够在种子中潜伏存在，从而在检疫检测中逃避肉眼观察。
传统的诊断方法，包括基于症状的评估、选择性培养基以及生化或血清学检测，不仅耗时较长，还需要专业的技能，而且往往缺乏种子健康检测所需的灵敏度和特异性[3]。由于B. glumae和B. gladioli在生理特性上较为相似，而X. oryzae pv. oryzicola和X. oryzae pv. oryzae的寄主范围也有重叠，因此传统方法难以实现物种级别的准确鉴定，尤其是在混合感染或病原体浓度较低的情况下，这就凸显出迫切需要灵敏的分子检测工具。
分子诊断工具的出现，尤其是基于聚合酶链反应的检测方法，彻底改变了植物病原体的检疫检测方式。传统的PCR、定量实时PCR以及数字PCR检测方法都具有高灵敏度、高特异性且检测速度快等优点，能够直接从植物组织或种子中检测出病原体，无需事先进行微生物分离[7, 8]。
不过，对于常规的大规模监测、检疫检测以及种子认证工作来说，多重PCR仍然是首选方法，因为它价格低廉、操作简便，且能在一次反应中检测多个目标。它在种子健康检测、植物检疫、大规模疫情监测以及同时检测多种病原体（包括线虫[9]、真菌[10]、细菌[11]和病毒[12]）方面都具有显著优势，远优于传统的单靶标PCR方法。最近，Bangratz等人[11]应用多重PCR方法检测了西非256份水稻叶片样本中的共感染情况，发现多重检测格式下的检测限约为0.5 ng DNA μL-1，而在所分析的样本中并未检测到Burkholderia属的病原体。
在任何多重PCR诊断方法中，特定物种引物的设计都是决定其灵敏度和选择性的关键因素。在本研究中，目标基因的选择是根据这三种病原体的功能基因组注释来确定的，重点关注与致病性和宿主适应性相关的基因位点。对于X. oryzae pv. oryzae，研究选择了TonB依赖性受体基因作为检测目标。TonB依赖性的外膜蛋白在营养获取以及病原体与宿主的相互作用中起着关键作用，在Xanthomonas属病原体的致病过程中还会表现出差异性表达[13, 14]。
对于B. glumae，研究选择了YihY/毒力因子BrkB基因作为检测目标，该基因编码一种与致病性相关的外膜蛋白，能够在不同的B. glumae菌株中实现稳定且特异的扩增。而对于B. gladioli，则选择了编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因作为检测目标。虽然rpoB基因主要功能是作为核心转录成分，与致病性并无直接关联，但它作为分子标记对于准确检测和鉴定重要的植物病原体B. gladioli具有重要意义[15]。
尽管已有不少针对水稻细菌病原体的多重PCR检测方法被报道，但这些方法仍存在一些局限性。大多数先前开发的检测方法都是为检测多种病原体而设计的，因此在多重检测条件下，由于引物竞争和扩增偏差的问题，其分析灵敏度往往会下降[16, 17, 18]。此外，尽管这三种病原体在经济和检疫方面具有重要意义，但专门针对它们同时检测的研究却相对较少。
为了解决这些局限性，本研究专门开发了一种多重PCR检测方法，用于检测三种对水稻生产具有重要经济价值的全苗带菌病原体，即X. oryzae pv. oryzicola、B. glumae和B. gladioli。研究从功能相关的基因组位点出发，设计了针对TonB依赖性受体、YihY/毒力因子BrkB以及rpoB基因的物种特异性引物，以此在最大程度提高特异性的同时，减少与近缘细菌物种的交叉反应。这些引物对还在100-1 × 10-4 ng μL-1的基因组DNA浓度范围内通过基于SYBR Green的定量PCR进行了进一步验证，同时还在了人工感染的水稻种子上进行了实际检测。所开发的这种诊断技术能够同时检测这三种主要的水稻全苗带菌病原体，可在种子健康检测、检疫以及疾病监测等领域得到应用。
